تست سمیت سلولی (Cytotoxicity Assay) برای ارزیابی اثرات سمی یک ماده بر سلول‌های زنده است که این آزمایش میزان زنده‌مانی، تکثیر یا مرگ سلولی را در معرض ترکیبات شیمیایی، نانوذرات، داروها یا عوامل زیستی اندازه‌گیری می‌کند.
روش‌های متداول شامل MTT، MTS، LDH release، Annexin V/PI و Trypan Blue Exclusion هستند که هر یک با مکانیسم‌های خاصی مانند ارزیابی فعالیت میتوکندریایی، نشت لاکتات دهیدروژناز یا آپوپتوز سلولی، میزان سمیت را تعیین می‌کنند.
سنجش سمیت سلولی چگونه انجام می شود؟
سنجش سمیت سلولی بسته به نوع ترکیب مورد بررسی و مکانیسم تأثیر آن بر سلول‌ها با روش‌های مختلفی انجام می‌شود، اما به‌طور کلی شامل مراحل استانداردی است. ابتدا، خط سلولی مناسب (مانند سلول‌های سرطانی یا فیبروبلاست‌های طبیعی) در پلیت‌های کشت سلولی کشت داده شده و پس از رسیدن به چگالی مطلوب، در معرض غلظت‌های مختلف ماده مورد نظر قرار می‌گیرند.
سپس، بسته به روش انتخابی، پارامترهای حیاتی سلول ارزیابی می‌شوند. در روش MTT یا MTS، میزان فعالیت آنزیم‌های میتوکندریایی بررسی می‌شود که نشان‌دهنده زنده‌مانی سلولی است. روش LDH release بر اساس نشت لاکتات دهیدروژناز از سلول‌های نکروتیک عمل می‌کند. برای تمایز بین آپوپتوز و نکروز، Annexin V/PI استفاده می‌شود که فسفاتیدیل‌سرین خارجی‌شده در آپوپتوز و نفوذپذیری غشا در نکروز را تشخیص می‌دهد. در نهایت، داده‌ها با دستگاه‌های اسپکتروفتومتری، فلوسیتومتری یا میکروسکوپی فلورسانس تجزیه‌وتحلیل شده و میزان سمیت ماده محاسبه می‌شود.
جهت آشنایی با تست سمیت سلولی کلیک کنید.
سنجش سمیت سلولی به روش MTT چگونه انجام می شود؟
سنجش سمیت سلولی به روش MTT یک روش رنگ‌سنجی (Colorimetric) است که برای ارزیابی زنده‌مانی سلولی و تعیین سمیت داروها، ترکیبات شیمیایی و سایر عوامل استفاده می‌شود. این آزمون بر اساس کاهش تترازولیوم (MTT) به فرمازان نامحلول در سلول‌های زنده انجام می‌شود که نشان‌دهنده فعالیت متابولیکی آن‌ها است. مراحل انجام این تست به‌صورت زیر است:
کشت سلولی
سلول‌های موردنظر (مانند سلول‌های سرطانی یا فیبروبلاست‌ها) در پلیت 96 چاهکی کشت داده شده و اجازه داده می‌شود تا به چگالی مطلوب برسند.
اضافه کردن ماده مورد آزمایش
پس از انکوباسیون اولیه، سلول‌ها در معرض غلظت‌های مختلف از ترکیب موردنظر قرار گرفته و معمولاً به مدت 24 تا 48 ساعت انکوبه می‌شوند.
افزودن معرف MTT
محلول MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) به هر چاهک اضافه شده و پلیت برای 3 تا 4 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد و شرایط CO₂ کنترل‌شده انکوبه می‌شود.
تشکیل کریستال‌های فرمازان
در سلول‌های زنده، آنزیم‌های میتوکندریایی MTT را به کریستال‌های فرمازان بنفش‌رنگ کاهش می‌دهند، اما در سلول‌های مرده این تبدیل انجام نمی‌شود.
حل کردن کریستال‌های فرمازان
پس از حذف محیط کشت، حلال مناسب (مانند ایزوپروپانول یا DMSO) اضافه شده تا کریستال‌های فرمازان حل شوند.
اندازه‌گیری جذب نوری
میزان جذب نور در طول موج 570 نانومتر توسط دستگاه میکروپلیت ریدر (ELISA Reader) اندازه‌گیری شده و میزان سمیت یا زنده‌مانی سلولی محاسبه می‌شود.
تفسیر نتایج
میزان جذب نوری (OD) به طور مستقیم با تعداد سلول‌های زنده متناسب است؛ کاهش جذب نوری نشان‌دهنده افزایش سمیت و کاهش زنده‌مانی سلولی است. این روش به دلیل حساسیت بالا، سهولت اجرا و هزینه مقرون‌به‌صرفه، یکی از رایج‌ترین تست‌های سمیت سلولی در مطالعات زیست‌پزشکی و دارویی محسوب می‌شود.
جهت دریافت خدمات و مشاوره رایگان با نیکوفامد تماس بگیرید.
سنجش سمیت سلولی به روش LDH release چگونه انجام می شود؟
سنجش سمیت سلولی به روش LDH Release یک روش غیرمستقیم برای ارزیابی مرگ سلولی ناشی از نکروز است که بر پایه اندازه‌گیری نشت آنزیم لاکتات دهیدروژناز (LDH) از سلول‌های آسیب‌دیده یا تخریب‌شده به محیط کشت انجام می‌شود. این تست حساسیت بالایی دارد و به دلیل عدم نیاز به مراحل رنگ‌سنجی درون‌سلولی، برخلاف تست‌های MTT و MTS، یک روش غیرتهاجمی و بدون نیاز به لیز سلولی محسوب می‌شود.
کشت سلولی
سلول‌های موردنظر در پلیت 96 چاهکی کشت داده شده و پس از چسبیدن و رشد کافی، در معرض غلظت‌های مختلف ترکیب آزمایشی قرار می‌گیرند.
انکوباسیون با ماده مورد آزمایش
سلول‌ها برای مدت 24 تا 48 ساعت با ماده موردنظر تیمار شده و در دمای 37 درجه سانتی‌گراد و CO₂ کنترل‌شده نگهداری می‌شوند.
جمع‌آوری محیط رویی (Supernatant)
پس از انکوباسیون، محیط کشت سلولی که حاوی LDH نشت‌یافته از سلول‌های نکروتیک است، برداشت شده و برای آنالیز فعالیت LDH استفاده می‌شود.
افزودن سوبسترا
به محیط رویی جمع‌آوری‌شده، مخلوط واکنش حاوی NAD+، پیروات و معرف رنگی (مانند INT یا تترازولیوم) اضافه شده و به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق یا 37 درجه سانتی‌گراد انکوبه می‌شود.
اندازه‌گیری جذب نوری
فعالیت LDH با اندازه‌گیری جذب نوری محصول رنگی تشکیل‌شده در طول موج 490-450 نانومتر توسط دستگاه میکروپلیت ریدر (ELISA Reader) سنجیده می‌شود.
کنترل مثبت و منفی
برای اطمینان از دقت نتایج، کنترل مثبت (سلول‌های کاملاً لیز‌شده با Triton X-100) و کنترل منفی (سلول‌های تیمارنشده) در هر آزمایش گنجانده می‌شوند.
تفسیر نتایج
میزان جذب نوری (OD) مستقیماً با میزان LDH آزادشده از سلول‌های نکروتیک متناسب است. افزایش جذب نوری نشان‌دهنده افزایش سمیت و نکروز سلولی است، درحالی‌که مقادیر پایین‌تر حاکی از زنده‌مانی بالاتر سلول‌ها است. این روش برای ارزیابی سمیت داروها، ترکیبات نانو، و بررسی مرگ سلولی ناشی از عوامل شیمیایی یا فیزیکی کاربرد گسترده‌ای دارد.
سنجش سمیت سلولی به روش Trypan Blue Exclusion چگونه انجام می شود؟
آزمون Trypan Blue Exclusion یک روش کلاسیک و سریع برای ارزیابی زنده‌مانی سلولی است که بر اساس نفوذپذیری غشای سلولی انجام می‌شود. سلول‌های زنده دارای غشای سالم هستند و نمی‌توانند رنگ تریپان بلو را جذب کنند، در حالی که سلول‌های مرده به دلیل آسیب غشایی، رنگ را به داخل خود راه می‌دهند و به رنگ آبی دیده می‌شوند. این روش عمدتاً در آزمایش‌های کشت سلولی، ارزیابی سمیت دارویی و بررسی زنده‌مانی سلول‌ها پس از تیمارهای مختلف استفاده می‌شود.
کشت و تیمار سلول‌ها
سلول‌های مورد آزمایش در محیط مناسب کشت داده شده و پس از رسیدن به چگالی مطلوب، با دارو یا ترکیب موردنظر تیمار می‌شوند.
جمع‌آوری سلول‌ها
پس از دوره انکوباسیون، سلول‌ها با استفاده از تریپسین یا لوله‌کشی ملایم از سطح کشت جدا شده و سانتریفیوژ می‌شوند.
افزودن رنگ Trypan Blue
سلول‌های معلق در محیط مناسب با رنگ تریپان بلو 0.4% به نسبت 1:1 مخلوط شده و به مدت 1-3 دقیقه در دمای اتاق نگهداری می‌شوند.
شمارش سلولی با میکروسکوپ نوری
یک قطره از مخلوط رنگ‌آمیزی شده در لام نئوبار (هموسیتومتر) قرار داده شده و سلول‌های رنگ‌پذیر (مرده) و بدون رنگ (زنده) با میکروسکوپ نوری شمارش می‌شوند.
محاسبه درصد زنده‌مانی
زنده‌مانی سلولی با استفاده از فرمول زیر تعیین می‌شود:
% زنده‌مانی سلولی=(کل سلول‌ها (زنده + مرده)تعداد سلول‌های زنده)×100
تفسیر نتایج
درصد زنده‌مانی بالا (بالای 80%) نشان‌دهنده سلامت سلول‌ها و عدم سمیت ترکیب موردنظر است.
درصد زنده‌مانی پایین (کمتر از 50%) نشان‌دهنده اثرات سمی قوی و مرگ سلولی قابل‌توجه است.
آزمایشگاه همکار نیکوفارمد با بهره‌گیری از تجهیزات مدرن و رعایت استانداردهای بین‌المللی، آزمون سمیت سلولی به روش MTT را برای ارزیابی اثرات داروها، نانوذرات و ترکیبات شیمیایی بر زنده‌مانی سلولی انجام می‌دهد.نیکوفارمد با بهره‌گیری از تیمی متخصص، آماده ارائه خدمات تخصصی به شرکت‌های دارویی، مراکز تحقیقاتی و صنایع مرتبط است.