تست LAL (Limulus Amebocyte Lysate) روشی حساس و دقیق برای تشخیص اندوتوکسین‌های باکتری‌های گرم منفی در محصولات دارویی و تجهیزات پزشکی است. این تست بر پایه واکنش لخته‌شدنی است که در حضور اندوتوکسین‌ها در همولنف خرچنگ نعل اسبی (Limulus polyphemus) رخ می‌دهد. اندوتوکسین‌ها اجزای دیواره سلولی باکتری‌های گرم منفی هستند که می‌توانند واکنش‌های شدید ایمنی و تب در بدن انسان ایجاد کنند؛ بنابراین، اطمینان از عدم حضور آن‌ها در محصولات پزشکی بسیار حائز اهمیت است.
تست LAL به‌عنوان یک آزمون کنترل کیفیت، برای تشخیص و اندازه‌گیری اندوتوکسین‌های باکتریایی در محصولات تزریقی و دستگاه‌های پزشکی که با جریان خون یا مایع نخاعی در تماس هستند، استفاده می‌شود. این آزمون همچنین در نظارت بر سیستم‌های آب و مواد خام به‌کار می‌رود تا از انتقال اندوتوکسین‌ها به محصول نهایی جلوگیری شود.
جهت دریافت خدمات و مشاوره رایگان با نیکوفامد تماس بگیرید.
روش های انجام تست lal
روش ژل-کلات (Gel-Clot)
تست ژل کلات (Gel-Clot) یکی از روش‌های سنجش اندوتوکسین‌های باکتریایی است که بر اساس تشکیل لخته ژل در حضور اندوتوکسین انجام می‌شود. این روش به دلیل سادگی و هزینه کم، در بسیاری از آزمایشگاه‌ها مورد استفاده قرار می‌گیرد.
مراحل انجام تست ژل کلات
آماده‌سازی نمونه و معرف‌ها
نمونه مورد آزمایش را تهیه کنید.
معرف لیزات آمبوسیت لیمولوس (LAL) را مطابق دستورالعمل کیت آماده نمایید.
مخلوط کردن نمونه با معرف
مقدار مشخصی از نمونه (معمولاً 0.2 میلی‌لیتر) را به لوله حاوی معرف LAL اضافه کنید.
لوله را به آرامی تکان دهید تا مخلوط یکنواختی حاصل شود.
انکوباسیون
لوله‌ها را در دمای 37 درجه سانتی‌گراد به مدت 60 دقیقه انکوبه کنید.
در این مدت، در صورت وجود اندوتوکسین، واکنش بین LAL و اندوتوکسین منجر به تشکیل لخته ژل می‌شود.
بررسی نتایج
پس از انکوباسیون، لوله‌ها را به آرامی وارونه کنید.
اگر لخته ژل تشکیل شده باشد و در وارونه کردن لوله حفظ شود، نتیجه مثبت است؛ یعنی نمونه حاوی اندوتوکسین است.
اگر لخته‌ای تشکیل نشده باشد و مایع به‌راحتی جریان یابد، نتیجه منفی است؛ یعنی اندوتوکسینی در نمونه وجود ندارد.
این روش مطابق با آزمون اندوتوکسین‌های باکتریایی در فارماکوپه‌ها است و برای تشخیص سریع اندوتوکسین‌های باکتریایی در نمونه‌های مختلف تحقیقاتی و صنعتی استفاده می‌شود. همچنین، به تجهیزات آزمایشگاهی پیچیده‌ای نیاز ندارد و می‌تواند به‌سرعت نتایج قابل اطمینانی ارائه دهد.
جهت کسب اطلاعات بیشتر درباره آزمون اندوتوکسین کلیک کنید.
روش کروموژنیک (Chromogenic)
روش کروموژنیک در آزمایش LAL (Limulus Amebocyte Lysate) یکی از روش‌های حساس و دقیق برای اندازه‌گیری اندوتوکسین‌های باکتریایی است. این روش بر اساس تغییر رنگ ناشی از واکنش بین اندوتوکسین و یک سوبسترای کروموژنیک خاص عمل می‌کند.
مراحل انجام تست کروموژنیک LAL
آماده‌سازی نمونه و معرف‌ها
نمونه‌های مورد آزمایش را به‌طور مناسب رقیق کنید.
سوبسترای کروموژنیک و معرف LAL را طبق دستورالعمل کیت آماده نمایید.
انکوباسیون
مخلوط نمونه و معرف‌ها را در دمای مشخص (معمولاً 37 درجه سانتی‌گراد) برای مدت زمان معین انکوبه کنید.
در این مرحله، اندوتوکسین موجود در نمونه، زنجیره‌ای از واکنش‌های آنزیمی را در LAL فعال می‌کند که منجر به تجزیه سوبسترای کروموژنیک و تولید رنگ می‌شود.
اندازه‌گیری جذب نوری
پس از انکوباسیون، شدت رنگ تولید شده را با استفاده از اسپکتروفتومتر در طول موج 405 نانومتر اندازه‌گیری کنید.
میزان جذب نوری با غلظت اندوتوکسین در نمونه متناسب است؛ بنابراین، با مقایسه نتایج با منحنی استاندارد، می‌توان غلظت اندوتوکسین را تعیین کرد.
این روش به دلیل دقت و حساسیت بالا، برای تشخیص مقادیر کم اندوتوکسین در نمونه‌های بیولوژیکی و دارویی بسیار مناسب است. همچنین، امکان انجام آن به‌صورت کمی و کیفی وجود دارد.
روش کدورت‌سنجی (Turbidimetric)
روش کدورت‌سنجی یکی از روش‌های اندازه‌گیری اندوتوکسین‌های باکتریایی با استفاده از تست LAL (Limulus Amebocyte Lysate) است. در این روش، پس از افزودن LAL به نمونه، واکنش بین اندوتوکسین‌ها و LAL منجر به تشکیل کمپلکس‌هایی می‌شود که کدورت (تیرگی) در محلول ایجاد می‌کنند. میزان این کدورت با استفاده از دستگاه‌های اسپکتروفتومتر اندازه‌گیری می‌شود و با غلظت اندوتوکسین موجود در نمونه متناسب است.
مراحل انجام این روش به‌طور خلاصه عبارت‌اند از:
آماده‌سازی نمونه
نمونه‌های مورد آزمایش باید در شرایط استریل تهیه و در صورت لزوم رقیق شوند تا در محدوده حساسیت تست قرار گیرند.
تهیه استاندارد اندوتوکسین
برای تعیین منحنی استاندارد و کالیبراسیون، از محلول‌های استاندارد اندوتوکسین با غلظت‌های مشخص استفاده می‌شود.
افزودن LAL به نمونه و استانداردها
مقدار مشخصی از معرف LAL به هر یک از نمونه‌ها و محلول‌های استاندارد اضافه می‌شود.
انکوباسیون
مخلوط‌های تهیه‌شده در دمای معین (معمولاً 37 درجه سانتی‌گراد) و برای مدت زمان مشخصی انکوبه می‌شوند تا واکنش بین اندوتوکسین و LAL کامل شود.
اندازه‌گیری کدورت
پس از انکوباسیون، میزان کدورت هر نمونه با استفاده از اسپکتروفتومتر در طول موج معین (معمولاً 410 نانومتر) اندازه‌گیری می‌شود.
تجزیه و تحلیل نتایج
با مقایسه مقادیر کدورت نمونه‌ها با منحنی استاندارد، غلظت اندوتوکسین در هر نمونه تعیین می‌شود.
این روش به دلیل دقت و حساسیت بالا، برای سنجش مقادیر کم اندوتوکسین در نمونه‌های مختلف مورد استفاده قرار می‌گیرد.
چرا تست LAL اهمیت دارد؟
کنترل ایمنی داروها و تجهیزات پزشکی
اندوتوکسین‌ها در صورت حضور در داروهای تزریقی یا وسایل پزشکی (مانند ایمپلنت‌ها) می‌توانند باعث واکنش‌های شدید در بدن شوند، بنابراین تست LAL برای تضمین ایمنی بیماران ضروری است.
جایگزین روش‌های حیوانی
این روش نسبت به تست تب‌زایی بر روی خرگوش‌ها دقیق‌تر، سریع‌تر و اخلاقی‌تر است و امروزه به عنوان استاندارد بین‌المللی در کنترل کیفیت شناخته می‌شود.
حساسیت و دقت بالا
تست LAL می‌تواند مقادیر ناچیز اندوتوکسین را در حد پیکوگرم در میلی‌لیتر شناسایی کند که از روش‌های قدیمی دقیق‌تر است.
کاربرد گسترده در صنایع داروسازی و بیولوژیک
این تست برای بررسی ایمنی انسولین، واکسن‌ها، سرم‌ها و مایعات تزریقی بسیار مهم است.
آزمایشگاه همکار نیکوفارمد تست (Limulus Amebocyte Lysate)LAL را که برای تشخیص اندوتوکسین‌های باکتریایی استفاده می‌شود، به روش ژل کلات انجام می‌دهد.تست lal یکی از دقیق‌ترین روش‌های موجود برای اطمینان از ایمنی محصولات دارویی و پزشکی محسوب می‌شود.