آزمون اندوتوکسین چیست؟

اندوتوکسین‌ها ترکیبات لیپوپلی‌ساکاریدی (LPS) هستند که در غشای بیرونی باکتری‌های گرم منفی وجود دارند. این مولکول‌ها در اثر مرگ، لیز یا تکثیر باکتری آزاد می‌شوند و می‌توانند در غلظت‌های بسیار پایین موجب تب، شوک سپتیک یا پاسخ‌های التهابی شدید شوند. بنابراین در فرآیندهای دارویی، بیوتکنولوژیک و پزشکی باید کنترل و حذف آن‌ها با دقت بسیار انجام شود.

رایج‌ترین روش، آزمون LAL (Limulus Amebocyte Lysate) است که به سه فرمت ژل‌کلات (gel-clot)،کدورت‌سنجی (turbidimetric) و کروموژنیک (chromogenic) انجام می‌شود؛ جایگزین نوین و غیرحیوانی آن «فاکتور C نوترکیب» (rFC) است. نتایج معمولاً بر حسب «واحد اندوتوکسین» (EU/mL یا EU/device) گزارش می‌شود و باید با حدود مجاز استاندارد (مانند<USP 85>  یا Ph. Eur. 2.6.14) تطبیق یابد.

نتایج تست اندوتوکسین طبق استانداردهای بین‌المللی مانند فارماکوپه ایالات متحده (USP 85) و فارماکوپه اروپا (EP 2.6.14) انجام می شود.

جهت دریافت خدمات و مشاوره رایگان با نیکوفامد تماس بگیرید.

اندوتوکسین چیست؟

اندوتوکسین در واقع لیپوپلی‌ساکارید (LPS) موجود در غشای خارجی باکتری‌های گرم منفی است. این مولکول سه بخش اصلی دارد:

• لیپید A: بخش سمی و مسئول اصلی اثرات بیولوژیک (تب، شوک سپتیک).
• هسته‌ی الیگوساکاریدی: بخش میانی که لیپید A را به آنتی‌ژن O متصل می‌کند.
• آنتی‌ژن O: زنجیره پلی‌ساکاریدی متغیر که ویژگی سرولوژیک باکتری را تعیین می‌کند.

هنگام لیز شدن یا مرگ باکتری، این LPS آزاد شده و به عنوان pyrogen (تب‌زا) شناخته می‌شود. حتی مقادیر بسیار ناچیز آن (چند EU/mL) می‌تواند واکنش‌های شدیدی در بدن ایجاد کند.

چطور حد مجاز مناسب را انتخاب کنیم؟

قاعده کلی: حد مجاز اندوتوکسین = K ÷ M

• K: حداکثر اندوتوکسین مجاز بر اساس مسیر تجویز

تزریق معمولی (IV/IM/SC): ۵ EU/kg

اینتراتکال (داخل نخاع): ۰٫۲ EU/kg

• M: بیشترین مقدار محصولی که بیمار به ازای هر کیلوگرم بدن در یک نوبت می‌گیرد (mL/kg یا واحد/kg).

چطور محاسبه می شود؟

مسیر تجویز ⇒ K

بیشترین دوز واقعی بیمار را بر حسب kg ⇒ M

فرمول: حد مجاز = K ÷ M

نوع گزارش: برای محلول‌ها EU/mL، برای دُز/دستگاه‌ها EU/واحد یا EU/device.

برای مثال :

سرم IV که حداکثر ۱۰ mL/kg در یک نوبت تزریق می‌شود:

حد مجاز = ۵ ÷ ۱۰ = ۰٫۵ EU/mL

همان محصول اگر اینتراتکال بود:

حد مجاز = ۰٫۲ ÷ ۱۰ = ۰٫۰۲ EU/mL (سخت‌گیرانه‌تر)

نکات مهم

اگر چند محصول هم‌زمان داده می‌شوند، جمع EU همه‌شان نباید از K بیشتر شود.

برای پودر لیوفیلیزه، محاسبه را بر اساس حجم رقیق‌سازی نهایی انجام بده.

برای دستگاه‌ها، حد را بر پایه تماس واقعی با بیمار به صورت EU/device تعیین می شود.

مکانیسم تب‌زایی اندوتوکسین

مکانیسم تب‌زایی ناشی از اندوتوکسین به صورت مرحله‌ای اتفاق می‌افتد:

تشخیص توسط سیستم ایمنی ذاتی

لیپید A از LPS به‌وسیله‌ی گیرنده‌های اختصاصی مانند TLR4 (Toll-like receptor 4) و MD-2/CD14 complex روی سطح مونوسیت‌ها و ماکروفاژها شناسایی می‌شود.

فعال‌سازی سلول‌های ایمنی

این اتصال مسیر NF-κB را فعال می‌کند.در نتیجه سلول‌های ایمنی شروع به ترشح سایتوکاین‌های پیروژنیک اندوژن مثل IL-1β، TNF-α و IL-6 می‌کنند.

اثر بر هیپوتالاموس

سایتوکاین‌ها از طریق خون به هیپوتالاموس قدامی می‌رسند یا سلول‌های اندوتلیال مغزی را تحریک می‌کنند. آن‌ها موجب تولید پروستاگلاندین E2 (PGE2) می‌شوند.

تنظیم دمای بدن

PGE2 روی نورون‌های مرکز تنظیم دما در هیپوتالاموس اثر گذاشته و set-point دمای بدن را افزایش می‌دهد. بدن برای رسیدن به این دمای جدید، واکنش‌هایی مانند لرز، انقباض عروقی و افزایش متابولیسم را آغاز می‌کند → در نتیجه تب ایجاد می‌شود.

انواع روش های آزمون اندوتوکسین

تست LAL (Limulus Amebocyte Lysate) به عنوان یکی از روش‌های استاندارد برای سنجش اندوتوکسین‌ها در محصولات دارویی و بیولوژیکی شناخته شده است. این تست از سه روش مختلف برای تشخیص و اندازه‌گیری اندوتوکسین‌ها استفاده می‌کند که به شرح زیر است:

1.روش ژل کلات (Gel-clot method)

این روش مبتنی بر توانایی اندوتوکسین برای فعال کردن عامل پروتئینی در LAL است که منجر به تشکیل ژل می‌شود. نمونه به لیزات امبوسیت لیمولوس اضافه می‌شود و در صورت وجود اندوتوکسین، محلول به ژل تبدیل می‌شود. این واکنش نشان‌دهنده حضور اندوتوکسین در نمونه است. روش ژل کلات به دلیل سادگی و هزینه کم، بسیار محبوب است اما حساسیت آن کمتر از دیگر روش‌های LAL است.

2. روش کروموژنیک (Chromogenic method)

روش کروموژنیک بر پایه تغییر رنگ ناشی از واکنش بین اندوتوکسین و یک سوبسترا کروموژنیک خاص است. در این روش، اندوتوکسین‌ها باعث فعال‌سازی یک زنجیره انزیمی در LAL می‌شوند که نهایتاً به تولید رنگ منجر می‌شود. این رنگ می‌تواند به طور کمی با استفاده از اسپکتروفتومتر اندازه‌گیری شود. روش کروموژنیک برای تعیین مقادیر کم اندوتوکسین مناسب است و دقت بالایی دارد.

3. روش کدورت سنجی (Turbidimetric method)

در روش کدورت‌سنجی، میزان کدورت نمونه‌ای که به آن LAL اضافه شده، اندازه‌گیری می‌شود. این کدورت ناشی از تشکیل پیچیده‌های ناپایدار بین اندوتوکسین و عوامل درون LAL است. میزان کدورت با استفاده از نفوذ نور و اندازه‌گیری میزان نوری که از نمونه عبور می‌کند، سنجیده می‌شود. این روش برای سنجش سریع و دقیق اندوتوکسین در محدوده‌های گسترده‌ای از غلظت‌ها مناسب است.
هر یک از این روش‌ها بسته به نوع نمونه و دقت مورد نیاز در تشخیص اندوتوکسین می‌تواند استفاده شود. انتخاب روش مناسب بر اساس نیاز خاص تست و شرایط آزمایشگاهی تعیین می‌گردد.

جهت آشنایی با آزمون های میکروبی کلیک کنید.

مراحل انجام تست اندوتوکسین به روش ژل-کلات (Gel-Clot Method)

طبق USP <85> (Bacterial Endotoxins Test)، روش ژل-کلات (Gel-Clot method) ساده‌ترین و در عین حال معتبرترین تکنیک برای شناسایی وجود اندوتوکسین‌های باکتری‌های گرم منفی در نمونه‌هاست. روند انجام آزمون به شکل زیر است:

آماده‌سازی نمونه و رقیق‌سازی

نمونه‌ی دارویی یا بیولوژیک بر اساس ضریب حساسیت آزمون (λ) و حداکثر غلظت قابل آزمون (Maximum Valid Dilution, MVD) رقیق می‌شود تا از بروز تداخل (inhibition یا enhancement) جلوگیری گردد.

افزودن واکنشگر LAL

حجم مساوی از محلول رقیق‌شده نمونه و معرف Limulus Amebocyte Lysate در لوله‌های استریل و پایرژن‌فری مخلوط می‌گردد.

انکوباسیون

لوله‌ها در دمای 37 ± 1°C به مدت دقیق 60 ± 2 دقیقه در شرایط پایرژن‌فری انکوبه می‌شوند، بدون هیچ‌گونه تکان یا لرزش.

خوانش نتایج (کلات شدن)

پس از پایان زمان انکوباسیون، هر لوله به‌آرامی ۱۸۰ درجه برگردانده می‌شود.

تشکیل ژل پایدار که فرو نمی‌ریزد → نتیجه مثبت (وجود اندوتوکسین)

عدم تشکیل ژل یا ژل ناپایدار → نتیجه منفی (عدم شناسایی اندوتوکسین در حد حساسیت تست)

کنترل‌ها

• کنترل مثبت (محلول اندوتوکسین مرجع + LAL) برای اثبات صحت حساسیت واکنشگر.
• کنترل منفی (آب پایرژن‌فری + LAL) برای اطمینان از نبود آلودگی.
• کنترل بازیابی مثبت (نمونه + مقدار مشخص اندوتوکسین مرجع) جهت بررسی وجود تداخل احتمالی.

این روش یک آزمون کیفی است و تنها حضور یا عدم حضور اندوتوکسین را نسبت به حساسیت معرف (λ، مثلاً 0.125 EU/mL یا 0.25 EU/mL) نشان می‌دهد و به همین دلیل در فارماکوپه به‌عنوان reference method معرفی شده است.

جهت کسب اطلاعات بیشتر در رابطه با اندوتوکسین و اگزوتوکسین کلیک کنید.

تفاوت‌های تست اندوتوکسین و تست تب‌زایی درون‌تنی در خرگوش

معیار	تست تب‌زایی درون‌تنی خرگوش (Rabbit Pyrogen Test)	تست تب‌زایی برون‌تنی LAL (Limulus Amebocyte Lysate)
نوع تست	بیولوژیک درون‌تنی (In Vivo)	بیوشیمیایی برون‌تنی (In Vitro)
نمونه آزمایشی	خرگوش زنده	لیزات سلول‌های آمیبوسیت خرچنگ نعل اسبی (Limulus)
نوع پیروژن قابل شناسایی	همه انواع پیروژن‌ها (اندوتوکسین، اگزوتوکسین، باقی‌مانده‌های سلولی و…)	فقط اندوتوکسین‌های باکتری‌های گرم منفی
حساسیت	کمتر از LAL (وابسته به دوز و پاسخ بیولوژیک حیوان)	بسیار بالا (حتی مقادیر پیکوگرم اندوتوکسین را شناسایی می‌کند)
معیار ارزیابی	افزایش دمای بدن خرگوش (بیش از 0.5 درجه سانتی‌گراد)	ایجاد ژل یا کدورت در لیزات بر اثر وجود اندوتوکسین
مدت زمان انجام	معمولاً ۳ تا ۵ ساعت (گاهی بیشتر با دوره‌های پیش‌آزمایی)	حدود ۳۰ تا ۶۰ دقیقه
هزینه و منابع	پرهزینه، نیازمند مراقبت حیوانات زنده، محیط کنترل‌شده	کم‌هزینه‌تر، بدون نیاز به حیوان زنده
محدودیت‌های قانونی و اخلاقی	محدودیت‌های اخلاقی به دلیل استفاده از حیوانات	فاقد محدودیت‌های اخلاقی حیوانی
کاربرد رایج	محصولات پیچیده یا مشکوک به پیروژن‌های غیراندوتوکسینی	محصولات تزریقی، داروها و تجهیزات پزشکی فاقد پیروژن‌های غیراندوتوکسینی

نکات مهم

یکی از اصلی‌ترین تفاوت‌ها این است که تست تب‌زایی خرگوش توانایی شناسایی تمامی انواع پیروژن‌ها را دارد، اما تست LAL تنها مختص اندوتوکسین‌های گرم منفی است. بنابراین برای محصولاتی که احتمال وجود پیروژن‌های غیراندوتوکسینی (مانند اگزوتوکسین‌های باکتری‌های گرم مثبت یا باقی‌مانده‌های قارچی) در آن‌ها هست، تست خرگوش همچنان انتخاب الزامی است.

با پیشرفت روش‌های برون‌تنی و قوانین حمایت از حیوانات، تست LAL تا حد زیادی جایگزین تست تب‌زایی خرگوش شده است؛ اما در محصولاتی با ترکیبات پیچیده یا مشکوک به حضور انواع مختلف پیروژن‌ها، آزمون خرگوش هنوز مرجع نهایی است.

برای داروها و تجهیزات تزریقی ساده تست LAL کافی است.

برای فرآورده‌های بیولوژیک پیچیده یا محصولاتی با ترکیبات ناشناخته انجام تست تب‌زایی خرگوش توصیه می‌شود یا ترکیب هر دو تست جهت پوشش کامل خطرات.

جهت آشنایی با آزمون استریلیتی کلیک کنید.

چطور می توان از آلودگی اندوتوکسین جلوگیری کرد؟

پیشگیری در مرحله نمونه‌گیری

• نمونه‌های بیولوژیکی (خون، سرم، مایع مغزی‌نخاعی، ادرار)

استفاده از ظروف شیشه‌ای یا پلاستیکی Endotoxin-free (تأیید شده با آزمون LAL).

پرهیز از استفاده از سرنگ‌ها یا تیوب‌هایی که از قبل استریل نشده یا در تماس با هوا و دست بوده‌اند.

رعایت کامل آسپسی مطلق هنگام نمونه‌گیری.

نگهداری در دمای مناسب (۴°C برای کوتاه‌مدت یا -20°C تا -80°C برای ذخیره‌سازی بلندمدت) برای جلوگیری از رشد باکتری گرم منفی.

• نمونه‌های دارویی یا بیوتکنولوژیک (مانند واکسن، پروتئین‌های نوترکیب، محلول‌های تزریقی)

استفاده از آب تزریقی (Water for Injection, WFI) که از سیستم‌های تقطیر دو مرحله‌ای عبور کرده و فاقد اندوتوکسین است.

استفاده از تجهیزات و لوله‌های غیرباکتری‌دوست (non-pyrogenic materials).

نمونه‌گیری در محیط کلاس A یا B (cleanroom با HEPA filtration).

کنترل در فرآیند تولید و آماده‌سازی

کنترل آب و مواد اولیه

سیستم آب باید دارای نقاط استریل‌گیری و مانیتورینگ دوره‌ای اندوتوکسین باشد (آزمون LAL).

استفاده از فیلترهای ۰٫۲۲ میکرومتر برای حذف باکتری‌ها در محلول‌های نهایی.

عدم استفاده از مواد اولیه حیوانی تصفیه‌نشده.

شستشو و ضدعفونی تجهیزات

شستشو با آب گرم WFI (۸۰–۹۰°C) یا بخار اشباع برای از بین بردن اندوتوکسین‌ها.

در موارد خاص، استفاده از NaOH 0.1–1 M برای تجزیه LPSها.

خشک‌کردن در دمای بالا (حداقل 250°C برای ۳۰ دقیقه) برای از بین بردن کامل پیروژن‌ها — به‌ویژه در وسایل شیشه‌ای.

طراحی سیستم تولید

اجتناب از نقاط مرده (dead legs) در خطوط لوله‌کشی.

گردش مداوم آب و جلوگیری از رکود.

کنترل دمای خطوط لوله (معمولاً بالای ۸۰°C) برای جلوگیری از رشد باکتری.

کنترل در مرحله ذخیره و انتقال

استفاده از ظروف دربسته و استریل، تأیید شده برای عدم جذب LPS.

جلوگیری از تماس با هوا یا گرد و غبار (که ممکن است حامل باکتری‌های گرم منفی باشند).

برای فرآورده‌های مایع، نگهداری در دمای پایین و در صورت لزوم افزودن مواد نگهدارنده مجاز.

کنترل کیفیت (QC)

آزمون LAL (Limulus Amebocyte Lysate) برای ارزیابی سطح اندوتوکسین در نمونه‌ها.

در موارد حساس، آزمون rFC (Recombinant Factor C) جایگزین انسانی و بدون استفاده از خون خرچنگ نعل‌اسبی.

انجام تست‌های تأییدی (inhibition/enhancement test) برای اطمینان از عدم تداخل ماتریکس نمونه.

 حذف اندوتوکسین در صورت آلودگی

اگر نمونه یا محصول آلوده شده باشد:

Depyrogenation با حرارت خشک (۲۵۰°C برای شیشه‌جات).

فیلتراسیون با فیلترهای نانویی یا آغشته به پلی‌اتیلن‌آمین برای محلول‌ها.

کروماتوگرافی تبادل یونی یا آبدوست-آبگریز (HIC) در فرآورده‌های پروتئینی.

شستشو با محلول‌های قلیایی (NaOH، Na₂CO₃) برای سطوح فلزی یا شیشه‌ای.

آزمایشگاه همکار نیکوفارمد با تکیه بر تیمی متخصص و بهره‌گیری از تجهیزات پیشرفته، خدمات تخصصی و دقیق در زمینه انجام آزمون اندوتوکسین (Endotoxin Test) ارائه می‌دهد. تست اندوتوکسین با هدف اندازه‌گیری و کنترل میزان اندوتوکسین‌ها در محصولات دارویی و تجهیزات پزشکی انجام می‌شود و نقشی حیاتی در تضمین ایمنی، کارایی و سلامت محصولات دارد.

تعهد نیکوفارمد به به‌کارگیری فناوری‌های روز، رعایت استانداردهای بین‌المللی (نظیر USP، EP و FDA) و بهره‌مندی از نیروی انسانی آموزش‌دیده و مجرب، اطمینان از دقت، صحت و قابلیت اطمینان نتایج آزمایش‌ها را فراهم ساخته است