آزمون اندوتوکسین چیست؟
آزمون اندوتوکسین (Bacterial Endotoxin Test, BET) یک آزمون میکروبیولوژیک و الزامی در کنترل کیفی فرآورده‌های تزریقی، محلول‌های همودیالیز و محصولات بیولوژیک است که به منظور شناسایی و اندازه‌گیری اندوتوکسین‌های باکتری‌های گرم منفی انجام می‌شود.
اندوتوکسین‌ها اجزای لیپوپلی‌ساکاریدی غشای خارجی این باکتری‌ها هستند که در صورت ورود به جریان خون می‌توانند منجر به تب‌زایی (pyrogenicity)، التهاب سیستمیک و حتی شوک سپتیک شوند. مهم‌ترین و رایج‌ترین روش آزمون، LAL test (Limulus Amebocyte Lysate) است که بر اساس فعال‌سازی مسیر انعقادی سلول‌های آمیب نعل‌اسبی در حضور اندوتوکسین عمل می‌کند.
نتایج این آزمون معیاری قطعی برای تأیید ایمنی محصول بوده و در استانداردهای بین‌المللی مانند فارماکوپه ایالات متحده (USP 85) و فارماکوپه اروپا (EP 2.6.14) به‌عنوان آزمون مرجع معرفی شده است.
جهت دریافت خدمات و مشاوره رایگان با نیکوفامد تماس بگیرید.
اندوتوکسین چیست؟
اندوتوکسین در واقع لیپوپلی‌ساکارید (LPS) موجود در غشای خارجی باکتری‌های گرم منفی است. این مولکول سه بخش اصلی دارد:
- لیپید A: بخش سمی و مسئول اصلی اثرات بیولوژیک (تب، شوک سپتیک).
- هسته‌ی الیگوساکاریدی: بخش میانی که لیپید A را به آنتی‌ژن O متصل می‌کند.
- آنتی‌ژن O: زنجیره پلی‌ساکاریدی متغیر که ویژگی سرولوژیک باکتری را تعیین می‌کند.
هنگام لیز شدن یا مرگ باکتری، این LPS آزاد شده و به عنوان pyrogen (تب‌زا) شناخته می‌شود. حتی مقادیر بسیار ناچیز آن (چند EU/mL) می‌تواند واکنش‌های شدیدی در بدن ایجاد کند.
مکانیسم تب‌زایی اندوتوکسین
مکانیسم تب‌زایی ناشی از اندوتوکسین به صورت مرحله‌ای اتفاق می‌افتد:
تشخیص توسط سیستم ایمنی ذاتی
لیپید A از LPS به‌وسیله‌ی گیرنده‌های اختصاصی مانند TLR4 (Toll-like receptor 4) و MD-2/CD14 complex روی سطح مونوسیت‌ها و ماکروفاژها شناسایی می‌شود.
فعال‌سازی سلول‌های ایمنی
این اتصال مسیر NF-κB را فعال می‌کند.در نتیجه سلول‌های ایمنی شروع به ترشح سایتوکاین‌های پیروژنیک اندوژن مثل IL-1β، TNF-α و IL-6 می‌کنند.
اثر بر هیپوتالاموس
سایتوکاین‌ها از طریق خون به هیپوتالاموس قدامی می‌رسند یا سلول‌های اندوتلیال مغزی را تحریک می‌کنند. آن‌ها موجب تولید پروستاگلاندین E2 (PGE2) می‌شوند.
تنظیم دمای بدن
PGE2 روی نورون‌های مرکز تنظیم دما در هیپوتالاموس اثر گذاشته و set-point دمای بدن را افزایش می‌دهد. بدن برای رسیدن به این دمای جدید، واکنش‌هایی مانند لرز، انقباض عروقی و افزایش متابولیسم را آغاز می‌کند → در نتیجه تب ایجاد می‌شود.
انواع روش های آزمون اندوتوکسین
تست LAL (Limulus Amebocyte Lysate) به عنوان یکی از روش‌های استاندارد برای سنجش اندوتوکسین‌ها در محصولات دارویی و بیولوژیکی شناخته شده است. این تست از سه روش مختلف برای تشخیص و اندازه‌گیری اندوتوکسین‌ها استفاده می‌کند که به شرح زیر است:
1.روش ژل کلات (Gel-clot method)
این روش مبتنی بر توانایی اندوتوکسین برای فعال کردن عامل پروتئینی در LAL است که منجر به تشکیل ژل می‌شود. نمونه به لیزات امبوسیت لیمولوس اضافه می‌شود و در صورت وجود اندوتوکسین، محلول به ژل تبدیل می‌شود. این واکنش نشان‌دهنده حضور اندوتوکسین در نمونه است. روش ژل کلات به دلیل سادگی و هزینه کم، بسیار محبوب است اما حساسیت آن کمتر از دیگر روش‌های LAL است.
2. روش کروموژنیک (Chromogenic method)
روش کروموژنیک بر پایه تغییر رنگ ناشی از واکنش بین اندوتوکسین و یک سوبسترا کروموژنیک خاص است. در این روش، اندوتوکسین‌ها باعث فعال‌سازی یک زنجیره انزیمی در LAL می‌شوند که نهایتاً به تولید رنگ منجر می‌شود. این رنگ می‌تواند به طور کمی با استفاده از اسپکتروفتومتر اندازه‌گیری شود. روش کروموژنیک برای تعیین مقادیر کم اندوتوکسین مناسب است و دقت بالایی دارد.
3. روش کدورت سنجی (Turbidimetric method)
در روش کدورت‌سنجی، میزان کدورت نمونه‌ای که به آن LAL اضافه شده، اندازه‌گیری می‌شود. این کدورت ناشی از تشکیل پیچیده‌های ناپایدار بین اندوتوکسین و عوامل درون LAL است. میزان کدورت با استفاده از نفوذ نور و اندازه‌گیری میزان نوری که از نمونه عبور می‌کند، سنجیده می‌شود. این روش برای سنجش سریع و دقیق اندوتوکسین در محدوده‌های گسترده‌ای از غلظت‌ها مناسب است.
هر یک از این روش‌ها بسته به نوع نمونه و دقت مورد نیاز در تشخیص اندوتوکسین می‌تواند استفاده شود. انتخاب روش مناسب بر اساس نیاز خاص تست و شرایط آزمایشگاهی تعیین می‌گردد.
جهت آشنایی با آزمون های میکروبی کلیک کنید.
مراحل انجام تست اندوتوکسین به روش ژل-کلات (Gel-Clot Method)
طبق USP <85> (Bacterial Endotoxins Test)، روش ژل-کلات (Gel-Clot method) ساده‌ترین و در عین حال معتبرترین تکنیک برای شناسایی وجود اندوتوکسین‌های باکتری‌های گرم منفی در نمونه‌هاست. روند انجام آزمون به شکل زیر است:
آماده‌سازی نمونه و رقیق‌سازی
نمونه‌ی دارویی یا بیولوژیک بر اساس ضریب حساسیت آزمون (λ) و حداکثر غلظت قابل آزمون (Maximum Valid Dilution, MVD) رقیق می‌شود تا از بروز تداخل (inhibition یا enhancement) جلوگیری گردد.
افزودن واکنشگر LAL
حجم مساوی از محلول رقیق‌شده نمونه و معرف Limulus Amebocyte Lysate در لوله‌های استریل و پایرژن‌فری مخلوط می‌گردد.
انکوباسیون
لوله‌ها در دمای 37 ± 1°C به مدت دقیق 60 ± 2 دقیقه در شرایط پایرژن‌فری انکوبه می‌شوند، بدون هیچ‌گونه تکان یا لرزش.
خوانش نتایج (کلات شدن)
پس از پایان زمان انکوباسیون، هر لوله به‌آرامی ۱۸۰ درجه برگردانده می‌شود.
تشکیل ژل پایدار که فرو نمی‌ریزد → نتیجه مثبت (وجود اندوتوکسین)
عدم تشکیل ژل یا ژل ناپایدار → نتیجه منفی (عدم شناسایی اندوتوکسین در حد حساسیت تست)
کنترل‌ها
- کنترل مثبت (محلول اندوتوکسین مرجع + LAL) برای اثبات صحت حساسیت واکنشگر.
- کنترل منفی (آب پایرژن‌فری + LAL) برای اطمینان از نبود آلودگی.
- کنترل بازیابی مثبت (نمونه + مقدار مشخص اندوتوکسین مرجع) جهت بررسی وجود تداخل احتمالی.
این روش یک آزمون کیفی است و تنها حضور یا عدم حضور اندوتوکسین را نسبت به حساسیت معرف (λ، مثلاً 0.125 EU/mL یا 0.25 EU/mL) نشان می‌دهد و به همین دلیل در فارماکوپه به‌عنوان reference method معرفی شده است.
تفاوت‌های تست اندوتوکسین و تست تب‌زایی درون‌تنی در خرگوش
| معیار | تست تب‌زایی درون‌تنی خرگوش (Rabbit Pyrogen Test) | تست تب‌زایی برون‌تنی LAL (Limulus Amebocyte Lysate) |
|---|---|---|
| نوع تست | بیولوژیک درون‌تنی (In Vivo) | بیوشیمیایی برون‌تنی (In Vitro) |
| نمونه آزمایشی | خرگوش زنده | لیزات سلول‌های آمیبوسیت خرچنگ نعل اسبی (Limulus) |
| نوع پیروژن قابل شناسایی | همه انواع پیروژن‌ها (اندوتوکسین، اگزوتوکسین، باقی‌مانده‌های سلولی و…) | فقط اندوتوکسین‌های باکتری‌های گرم منفی |
| حساسیت | کمتر از LAL (وابسته به دوز و پاسخ بیولوژیک حیوان) | بسیار بالا (حتی مقادیر پیکوگرم اندوتوکسین را شناسایی می‌کند) |
| معیار ارزیابی | افزایش دمای بدن خرگوش (بیش از 0.5 درجه سانتی‌گراد) | ایجاد ژل یا کدورت در لیزات بر اثر وجود اندوتوکسین |
| مدت زمان انجام | معمولاً ۳ تا ۵ ساعت (گاهی بیشتر با دوره‌های پیش‌آزمایی) | حدود ۳۰ تا ۶۰ دقیقه |
| هزینه و منابع | پرهزینه، نیازمند مراقبت حیوانات زنده، محیط کنترل‌شده | کم‌هزینه‌تر، بدون نیاز به حیوان زنده |
| محدودیت‌های قانونی و اخلاقی | محدودیت‌های اخلاقی به دلیل استفاده از حیوانات | فاقد محدودیت‌های اخلاقی حیوانی |
| کاربرد رایج | محصولات پیچیده یا مشکوک به پیروژن‌های غیراندوتوکسینی | محصولات تزریقی، داروها و تجهیزات پزشکی فاقد پیروژن‌های غیراندوتوکسینی |
نکات مهم
یکی از اصلی‌ترین تفاوت‌ها این است که تست تب‌زایی خرگوش توانایی شناسایی تمامی انواع پیروژن‌ها را دارد، اما تست LAL تنها مختص اندوتوکسین‌های گرم منفی است. بنابراین برای محصولاتی که احتمال وجود پیروژن‌های غیراندوتوکسینی (مانند اگزوتوکسین‌های باکتری‌های گرم مثبت یا باقی‌مانده‌های قارچی) در آن‌ها هست، تست خرگوش همچنان انتخاب الزامی است.
با پیشرفت روش‌های برون‌تنی و قوانین حمایت از حیوانات، تست LAL تا حد زیادی جایگزین تست تب‌زایی خرگوش شده است؛ اما در محصولاتی با ترکیبات پیچیده یا مشکوک به حضور انواع مختلف پیروژن‌ها، آزمون خرگوش هنوز مرجع نهایی است.
برای داروها و تجهیزات تزریقی ساده تست LAL کافی است.
برای فرآورده‌های بیولوژیک پیچیده یا محصولاتی با ترکیبات ناشناخته انجام تست تب‌زایی خرگوش توصیه می‌شود یا ترکیب هر دو تست جهت پوشش کامل خطرات.
جهت آشنایی با آزمون استریلیتی کلیک کنید.
فرایند های جلوگیری از ایجاد آلودگی اندوتوکسین
جلوگیری از آلودگی اندوتوکسین در محصولات بیولوژیکی و دارویی نیازمند یک سری فرایندهای دقیق و منظم است که شامل کنترل‌های محیطی، استریلیزاسیون، فرایندهای تولید، و آزمایش‌های مکرر می‌شود. در ادامه، به بررسی فرایندهای کلیدی برای جلوگیری از این نوع آلودگی پرداخته‌ایم.
کنترل‌های محیطی
حفظ محیط تولید به صورت استریل و تمیز از اهمیت بالایی برخوردار است. استفاده از مواد ضدعفونی‌کننده مؤثر و اطمینان از تمیزکاری دوره‌ای محیط می‌تواند در کاهش خطر آلودگی ناخواسته کمک کند.
محدود کردن دسترسی به مناطق تولید تنها به افراد آموزش دیده و مجاز و استفاده از لباس‌های مناسب برای جلوگیری از ورود آلاینده‌ها از محیط خارج.
استریلیزاسیون مواد و تجهیزات
استریلیزاسیون با استفاده از حرارت مرطوب یا خشک برای حذف هرگونه آلاینده بیولوژیکی که ممکن است حاوی اندوتوکسین باشد.
استفاده از فیلترهای با قابلیت جذب بالا برای حذف ذرات و میکروب‌ها از مواد اولیه قبل از ورود به فرایند تولید.
کنترل فرایندهای تولید
تولید در شرایط کاملاً استریل برای جلوگیری از هرگونه آلودگی میکروبی و غیرمیکروبی، به خصوص در مراحل حساس فرایند.
نظارت و کنترل دقیق بر شرایط فرایند، مانند pH و دما، که می‌تواند بر رشد باکتری‌های گرم منفی تأثیر بگذارد و از تشکیل اندوتوکسین‌ها جلوگیری کند.
آزمایش و بازرسی محصولات
انجام تست‌های منظم LAL برای اطمینان از عدم وجود اندوتوکسین در محصولات نهایی. این تست‌ها باید به صورت دوره‌ای و بر اساس دستورالعمل‌های استاندارد انجام شوند.
بررسی نمونه‌هایی از محصولات در مراحل مختلف تولید برای اطمینان از عدم وجود آلودگی و رعایت استانداردهای کیفی.
آموزش و پرورش کارکنان
برگزاری دوره‌های آموزشی برای کارکنان در مورد اهمیت رعایت اصول آسپتیک، شناسایی خطرات اندوتوکسین و روش‌های پیشگیری از آلودگی.
این فرایندها، زمانی که به درستی و با دقت اجرا شوند، می‌توانند به طور مؤثری خطر آلودگی اندوتوکسین را در محصولات بیولوژیکی کاهش دهند و ایمنی و کیفیت بالای محصولات را تضمین کنند.
آزمایشگاه همکار نیکوفارمد، با بهره‌گیری از کادری مجرب و تجهیزات پیشرفته، خدمات تخصصی در زمینه انجام تست اندوتوکسین را ارائه می‌دهد. این تست، که به منظور تعیین میزان اندوتوکسین‌ها در محصولات پزشکی و دارویی صورت می‌پذیرد، نقش کلیدی در تضمین ایمنی و سلامت محصولات ارائه شده دارد. تعهد آزمایشگاه به استفاده از فناوری‌های به روز و نیروی انسانی کارآمد، اطمینان از رعایت دقیق‌ترین استانداردهای بین‌المللی را ممکن ساخته و به پیشبرد اهداف کیفی شرکت نیکوفارمد در راستای ارتقاء سطح سلامت جامعه کمک شایانی می‌نماید.