آزمون مایکوپلاسما روشی تخصصی در میکروبیولوژی است که برای شناسایی آلودگی با باکتریهای جنس Mycoplasma استفاده میشود. این باکتریها از کوچکترین پروکاریوتهای آزادزی هستند که فاقد دیواره سلولی بوده و به همین دلیل، در برابر بسیاری از آنتیبیوتیکها (بهویژه بتالاکتامها) مقاوم هستند.
جهت دریافت خدمات و مشاوره رایگان با نیکوفامد تماس بگیرید.
ویژگیهای مایکوپلاسما
مایکوپلاسماها گروهی از باکتریهای پروکاریوت هستند که به دلیل ساختار منحصربهفرد و ویژگیهای زیستی خاص، جایگاه ویژهای در میکروبیولوژی پزشکی، دامپزشکی، و آزمایشگاهی دارند. در ادامه به مهمترین ویژگیهای مایکوپلاسما اشاره می کنیم.
عدم وجود دیواره سلولی
مایکوپلاسماها فاقد دیواره سلولی هستند و فقط یک غشای سیتوپلاسمی دارند که حاوی استرولها است. این ویژگی چند پیامد مهم دارد:
مقاومت ذاتی در برابر آنتیبیوتیکهایی که دیواره سلولی را هدف قرار میدهند، مانند پنیسیلین و سایر بتالاکتامها.
انعطافپذیری بالا در شکل و اندازه (پلئومورفیسم)، بهطوری که میتوانند از ساختارهای کروی تا رشتهای را بپذیرند.
اندازه کوچک و حداقل ژنوم
مایکوپلاسماها از کوچکترین موجودات آزادزی هستند، با اندازهای حدود 0.2 تا 0.3 میکرون، که امکان عبور از فیلترهای میکروبیولوژیکی را فراهم میکند.
ژنوم آنها بسیار کوچک (600-1200 کیلوباز) و مینیمال است که تنها ژنهای ضروری برای بقای مستقل و تکثیر را شامل میشود.
وابستگی به میزبان (پارازیتی بودن)
مایکوپلاسماها به دلیل ناتوانی در سنتز بسیاری از ترکیبات ضروری (مانند اسیدهای آمینه و نوکلئوتیدها)، به میزبان وابسته هستند.
این باکتریها بهطور معمول انگلهای اجباری سطحی یا داخلسلولی در انسان، حیوانات، و گیاهان هستند.
تکثیر آهسته
مایکوپلاسماها در مقایسه با بسیاری از باکتریها، رشد آهستهای دارند و زمان دوبرابر شدن آنها معمولاً بین 1 تا 6 ساعت است.
کشت آنها نیازمند محیطهای غنی مانند PPLO (Pleuropneumonia-like Organisms) است که حاوی استرولها و اسیدهای چرب باشد.
تنفس و متابولیسم انرژی
مایکوپلاسماها هوازی، بیهوازی اختیاری، یا بیهوازی اجباری هستند و از تخمیر قندها برای تولید انرژی استفاده میکنند. برخی گونهها از آرژنین برای تولید ATP بهره میگیرند.
بیماریزایی (پاتوژنز)
مایکوپلاسماها میتوانند طیف وسیعی از بیماریها را در انسان و حیوانات ایجاد کنند.در انسان گونههایی مانند Mycoplasma pneumoniae عامل بیماریهای تنفسی (مانند ذاتالریه آتیپیک)، و گونههایی مانند M. genitalium عامل عفونتهای اوروژنیتال هستند.
اثرات روی کشتهای سلولی
مایکوپلاسماها بهعنوان یکی از شایعترین عوامل آلودگی کشتهای سلولی، میتوانند:
بیان ژنها و متابولیسم سلولهای کشتشده را تغییر دهند.
نتایج تجربیات آزمایشگاهی را مختل کنند.
این آلودگی به دلیل اندازه کوچک مایکوپلاسما و توانایی آنها در عبور از فیلترهای 0.45 میکرون است.
ژنتیک تطبیقی
مایکوپلاسماها توانایی بالایی در فرار از سیستم ایمنی میزبان دارند، که بخشی از آن به دلیل تغییر آنتیژنهای سطحی (VSPs: Variable Surface Proteins) است.این قابلیت به بقا و ایجاد عفونت مزمن کمک میکند.
مقاومت آنتیبیوتیکی
مایکوپلاسماها علاوه بر مقاومت طبیعی به آنتیبیوتیکهای هدفگیرنده دیواره سلولی، در مواردی مقاومت اکتسابی به ماکرولیدها، فلوروکینولونها، و تتراسایکلینها نشان میدهند که درمان عفونتها را دشوار میکند.
مایکوپلاسماها به دلیل ویژگیهای منحصربهفرد، نهتنها در حوزه بیماریشناسی بلکه در زمینههای تحقیقاتی نیز اهمیت بالایی دارند. شناسایی و مدیریت مایکوپلاسماها نیازمند روشهای دقیق آزمایشگاهی و شناخت عمیق از زیستشناسی این میکروارگانیسم است.
برای آشنایی با انواع آزمون میکروبی کلیک کنید.
آزمون مایکوپلاسما به روش کشت
آزمون مایکوپلاسما به روش کشت یکی از روشهای تخصصی و سنتی برای تشخیص آلودگی باکتریهای جنس Mycoplasma است. این روش بر پایه جداسازی مایکوپلاسما در محیطهای کشت اختصاصی و شناسایی کلنیهای آن بر اساس ویژگیهای مورفولوژیک انجام میشود. اگرچه به دلیل زمانبر بودن و حساسیت پایین، امروزه روشهای مولکولی مانند PCR جایگزین این روش شدهاند، اما کشت همچنان یک روش مرجع (gold standard) برای تأیید نتایج یا مطالعات خاص محسوب میشود.
مراحل انجام آزمون مایکوپلاسما به روش کشت
نمونهگیری
نمونههای بالینی: مانند ترشحات تنفسی (سوآپ حلقی یا بینی)، مایع جنبی، مایع مفصلی، یا ادرار.
محیط کشت سلولی: برای تشخیص آلودگی مایکوپلاسما در کشتهای سلولی، معمولاً از محیط کشت سلولها یا مایعات رویی (supernatant) استفاده میشود.
نکته مهم: نمونه باید بهسرعت به آزمایشگاه منتقل شود، زیرا مایکوپلاسماها حساس به تغییرات دما و شرایط محیطی هستند.
محیط کشت مورد استفاده
مایکوپلاسماها نیازمند محیطهای کشت اختصاصی غنی از مواد مغذی هستند، زیرا توانایی سنتز بسیاری از ترکیبات اساسی مانند اسیدهای آمینه و اسیدهای نوکلئیک را ندارند. محیطهای رایج عبارتاند از:
- محیط جامد (PPLO آگار)
حاوی پپتون، عصاره مخمر، سرم حیوانی (حاوی استرولها)، و آنتیبیوتیک برای مهار سایر باکتریها.
مکملهایی مانند تیوگلیکولات یا گلوکز نیز ممکن است اضافه شوند.
- محیط مایع (PPLO براث)
مشابه محیط جامد، اما بدون آگار. برای افزایش تعداد باکتریها قبل از انتقال به محیط جامد استفاده میشود.
انکوباسیون
نمونهها در محیط جامد یا مایع تلقیح شده و در شرایط هوازی یا میکروآئروفیلیک انکوبه میشوند.
دمای انکوباسیون: 37 درجه سانتیگراد.
زمان انکوباسیون: معمولاً بین 7 تا 28 روز (بسته به گونه مایکوپلاسما و میزان آلودگی).
برای جلوگیری از تبخیر، صفحات محیط جامد در انکوباتور مرطوب نگهداری میشوند.
شناسایی کلنیها
ویژگیهای ظاهری کلنیها
کلنیهای مایکوپلاسما کوچک، شفاف، و دارای ظاهری شبیه به “تخممرغ نیمرو” هستند (مرکز متراکم با حاشیهای شفاف).
رنگآمیزی دیانآی (DAPI یا Hoechst)
کلنیها ممکن است با رنگآمیزی DNA شناسایی شوند که در زیر میکروسکوپ فلورسانس، حضور DNA باکتری را تأیید میکند.
آزمایشهای اختصاصیتر
شناسایی گونهها با استفاده از تستهای بیوشیمیایی (مانند تخمیر قند یا استفاده از آرژنین).
تأیید با PCR برای گونههای خاص.
روش انجام آزمون مایکوپلاسما به روش PCR
نمونهگیری
اولین مرحله در انجام آزمون PCR، تهیه نمونه مناسب است. کیفیت نمونه تأثیر مستقیم بر صحت و دقت نتایج دارد.
نمونههای بالینی: مانند سوآپهای تنفسی (حلقی یا بینی)، مایعات بدن (مایع مفصلی، مایع جنبی، یا ادرار)، یا خون.
نمونههای کشت سلولی: معمولاً از مایع رویی (supernatant) کشت سلولی استفاده میشود. اگر خطوط سلولی مورد بررسی هستند، میتوان از سلولها نیز استفاده کرد.
استخراج DNA
برای انجام PCR، DNA مایکوپلاسما باید از نمونه استخراج شود. این مرحله بسیار حساس است، زیرا آلودگی در این مرحله میتواند نتیجه آزمون را تحت تأثیر قرار دهد.
روشهای استخراج DNA
کیتهای تجاری آماده: کیتهای اختصاصی برای استخراج DNA باکتریال که شامل مراحل لیز سلولی، خالصسازی و شستشو است.
روشهای دستی: مانند استفاده از فنل-کلروفرم یا ستون سیلیکا. این روشها نیازمند مهارت و دقت بیشتری هستند.
کنترل کیفیت DNA
غلظت و خلوص DNA استخراجشده با استفاده از دستگاه نانودراپ یا اسپکتروفتومتر بررسی میشود. نسبت جذب در طول موجهای 260/280 باید بین 1.8 تا 2 باشد.
اطمینان از عدم حضور بازدارندهها (inhibitors) برای عملکرد صحیح PCR.
طراحی و آمادهسازی واکنش PCR
واکنش PCR بر پایه تکثیر توالیهای ژنتیکی اختصاصی مایکوپلاسما است. در این مرحله، نیاز به پرایمرهای اختصاصی و مواد مناسب برای واکنش PCR داریم.
اجزای واکنش PCR
پرایمرها: پرایمرهای طراحیشده باید اختصاصی ژنهای مایکوپلاسما باشند. معمولاً ژنهای اختصاصی مانند 16S rRNA بهعنوان هدف استفاده میشوند.
Taq Polymerase: آنزیم پلیمراز مقاوم به حرارت که برای تکثیر DNA استفاده میشود.
dNTPs: نوکلئوتیدهای آزاد برای سنتز DNA.
Buffer: محیط مناسب برای فعالیت آنزیم پلیمراز.
DNA Template: DNA استخراجشده از نمونه.
آب عاری از نوکلئاز (Nuclease-Free Water): برای تنظیم حجم نهایی واکنش.
تنظیمات PCR
حجم نهایی واکنش معمولاً ۲۰ تا ۲۵ میکرولیتر است.
غلظت مناسب پرایمرها (معمولاً ۰.۱ تا ۱ میکرومولار) و DNA باید تنظیم شود.
اجرای PCR
پس از آمادهسازی واکنش، نمونهها در دستگاه ترموسایکلر قرار میگیرند. مراحل اصلی چرخه PCR شامل موارد زیر است:
چرخههای حرارتی استاندارد
Denaturation (دناتوراسیون): شکستن پیوندهای هیدروژنی DNA دو رشتهای به تکرشتهای (دمای معمول: ۹۴-۹۵ درجه سانتیگراد به مدت ۳۰ ثانیه).
Annealing (اتصال پرایمر): اتصال پرایمرها به توالیهای هدف (دمای معمول: ۵۰-۶۰ درجه سانتیگراد به مدت ۳۰-۶۰ ثانیه).
Extension (طویلسازی): سنتز رشته جدید DNA توسط آنزیم Taq پلیمراز (دمای معمول: ۷۲ درجه سانتیگراد به مدت ۳۰-۶۰ ثانیه).
تعداد چرخهها: معمولاً ۳۰ تا ۴۰ چرخه برای تکثیر کافی DNA.
الکتروفورز و شناسایی محصول PCR
پس از پایان واکنش PCR، محصول تکثیرشده باید با استفاده از ژل آگارز بررسی شود.
مراحل الکتروفورز
تهیه ژل آگارز: غلظت ژل (معمولاً ۱-۲٪) بر اساس اندازه محصول PCR تنظیم میشود.
لادن کردن نمونهها: محصول PCR با یک رنگ نشانگر DNA (مانند GelRed یا Ethidium Bromide) ترکیب شده و در چاهکهای ژل بارگذاری میشود.
اجرای الکتروفورز: جریان الکتریکی اعمال میشود تا DNA به سمت قطب مثبت حرکت کند.
مشاهده تحت UV: محصول PCR در دستگاه UV مشاهده میشود و باندهای مربوط به DNA تکثیرشده نمایان میگردند.
اندازه محصول PCR
اندازه محصول PCR باید با استفاده از مارکر اندازه DNA (DNA Ladder) بررسی شود. اگر اندازه محصول تکثیرشده با اندازه مورد انتظار پرایمرها مطابقت داشته باشد، وجود مایکوپلاسما تأیید میشود.
کنترلهای آزمون PCR
برای افزایش دقت و اطمینان از نتایج، استفاده از کنترلها ضروری است:
کنترل مثبت: نمونهای که حاوی DNA مایکوپلاسما است، باید باند مورد انتظار را نشان دهد.
کنترل منفی: نمونهای بدون DNA (آب عاری از نوکلئاز) برای شناسایی آلودگی احتمالی در واکنش PCR.
کنترل داخلی: برای بررسی حضور بازدارندهها و صحت عملکرد واکنش.
آزمایشگاه همکار نیکوفارمد بهعنوان یکی از مراکز پیشرو در ارائه خدمات آزمایشگاهی، آزمون مایکوپلاسما را با بهرهگیری از روشهای پیشرفته مانند PCR و کشت اختصاصی انجام میدهد. این آزمایشگاه با استفاده از تجهیزات مدرن، محیطهای کشت استاندارد و تیمی متخصص، قادر به شناسایی سریع و دقیق آلودگیهای مایکوپلاسما در نمونههای بالینی و کشتهای سلولی است. رعایت استانداردهای بینالمللی، تضمین دقت نتایج و ارائه خدمات قابل اعتماد از ویژگیهای برجسته این مرکز برای محققان، صنایع داروسازی و آزمایشگاههای مرتبط است.