آزمون مایکوپلاسما چیست؟
آزمون مایکوپلاسما روشی برای شناسایی و تأیید عدم آلودگی در محصولات بیولوژیک، خطوط تولید/کشت سلولی و فرآوردههای مشتق از آنهاست. مایکوپلاسما بهدلیل فقدان دیوارهٔ سلولی با روشهای مرسوم قابلتشخیص نیست و میتوانند کیفیت و ایمنی محصول را مختل کنند. آزمون مایکوپلاسما طبق <USP 63> دو روش اصلی دارد:
روش کشت (Culture Method) که بر پایه کشت نمونه در محیطهای اختصاصی مانند محیط آگار و براث مایکوپلاسما و بررسی کلنیها به کمک میکروسکوپ فازکنتراست یا فلورسانس بوده و برای شناسایی ارگانیسمهای زنده با حساسیت بالا مناسب است.
روش مبتنی بر اسید نوکلئیک (Nucleic Acid Amplification Techniques – NAAT) مانند PCR یا Real-Time PCR که با تکثیر و آشکارسازی توالیهای اختصاصی DNA مایکوپلاسما، امکان تشخیص سریع و اختصاصی را فراهم میسازد.
انتخاب یا ترکیب این روشها باید بر اساس ماهیت نمونه، نیازهای رگولاتوری و نتایج اعتبارسنجی صورت گیرد تا اطمینان کامل از عدم آلودگی حاصل شود.
جهت دریافت خدمات و مشاوره رایگان با نیکوفامد تماس بگیرید.
مایکوپلاسما چیست و چه خطراتی دارد؟
مایکوپلاسماها کوچکترین میکروارگانیسمهای پروکاریوتی خودتکثیرشونده شناختهشده هستند که به جنس Mycoplasma از خانواده Mycoplasmataceae تعلق دارند و فاقد دیواره سلولی میباشند. این ویژگی موجب انعطافپذیری غشای سیتوپلاسمی و قابلیت عبور از فیلترهای متداول استریلسازی (قطر منافذ 0.22 میکرومتر) شده و آنها را بهطور ذاتی در برابر آنتیبیوتیکهایی که مسیر سنتز دیواره سلولی را هدف قرار میدهند (مانند بتالاکتامها) مقاوم میسازد.
اندازه آنها در محدوده 0.2 تا 0.3 میکرومتر است و به دلیل وابستگی شدید به سلول میزبان برای متابولیسم و تکثیر، بهعنوان انگلهای اجباری سلولی شناخته میشوند. رشد کند، نیاز تغذیهای پیچیده و فقدان ویژگیهای متداول باکتریایی، شناسایی آنها را با روشهای کلاسیک میکروبیولوژی دشوار میسازد.
خطرات آلودگی مایکوپلاسما عبارتاند از:
تغییر در ویژگیهای سلول میزبان: آلودگی میتواند مورفولوژی، چرخه سلولی، نرخ رشد و ظرفیت تمایزی سلولهای کشتشده را دستخوش تغییر کند.
تأثیر بر متابولیسم و بیان ژن: مایکوپلاسما با ترشح آنزیمها و فاکتورهای تعدیلکننده، مسیرهای سیگنالینگ، رونویسی و ترجمه را مختل کرده و موجب تغییر در پروفایل پروتئینی و بیوشیمیایی سلول میشود.
اختلال در نتایج پژوهشی و فرآیندهای تولید: آلودگی پنهان میتواند دادههای آزمایشگاهی را غیرقابل اعتماد کند و کیفیت محصولات بیولوژیک (مانند واکسنها، آنتیبادیها و فرآوردههای سلولی) را بهشدت کاهش دهد.
مقاومت دارویی ذاتی: به علت فقدان دیواره سلولی، بسیاری از آنتیبیوتیکهای رایج بیاثر هستند و حذف آلودگی بهروشهای شیمیایی یا دارویی دشوار است.
بیماریزایی انسانی: گونههایی مانند Mycoplasma pneumoniae، Mycoplasma hominis و Ureaplasma urealyticum میتوانند عامل عفونتهای تنفسی، ادراری-تناسلی و عفونتهای سیستمیک بهویژه در افراد دارای نقص ایمنی باشند.
به دلیل این خطرات، شناسایی و پایش مداوم مایکوپلاسما با روشهای معتبر بینالمللی (همچون روش کشت و تقویت اسید نوکلئیک طبق <USP 63> یا EP 2.6.7) یک ضرورت حیاتی در تضمین کیفیت محصولات بیولوژیک، کشتهای سلولی و تحقیقات زیستپزشکی محسوب میشود.
برای آشنایی با انواع آزمون میکروبی کلیک کنید.
چه نمونههایی نیازمند آزمون مایکوپلاسما هستند؟
طبق دستورالعملهای ICH Q5A و <USP <63، موارد زیر معمولاً باید تحت آزمون مایکوپلاسما قرار گیرند:
- بانکهای سلولی اصلی و کاری (Master Cell Bank / Working Cell Bank) پیش از استفاده در تولید
- بذرهای ویروسی (Virus Seed Stocks) در تولید واکسن
- برداشت سلولی (Cell Harvest) در فرآیندهای تولید بیولوژیک، پیش و پس از مراحل کلیدی تولید
- محصول نهایی فله (Bulk Harvest) پیش از فرمولاسیون نهایی، برای محصولاتی مانند آنتیبادیهای مونوکلونال، واکسنها و فرآوردههای سلولدرمانی
آزمون مایکوپلاسما چگونه انجام می شود؟
در <USP 63>دو رویکرد اصلی برای شناسایی و تأیید عدم آلودگی مایکوپلاسما تعریف شده است که هر یک دارای دستورالعمل، محدودیت و الزامات کنترل کیفی خاص خود هستند. در ادامه هر روش را بهصورت تخصصی و مرحلهبهمرحله توضیح میدهم.
روش کشت (Culture Method)
این روش بهعنوان روش مرجع (Reference Method) در <USP 63> شناخته میشود و هدف آن شناسایی مایکوپلاسما های زنده از طریق رشد در محیطهای اختصاصی است.
اصول و محیطها:
استفاده از دو محیط اختصاصی شامل مایکوپلاسما براث (Mycoplasma Broth) برای غنیسازی و مایکوپلاسما آگار (Mycoplasma Agar) برای جداسازی و مشاهده کلنی.
محیطها معمولاً حاوی سرم اسب یا گاو، DNA مخمر، و مواد مهارکننده رشد سایر باکتریها هستند.
مراحل انجام طبق <USP 63>
نمونهگیری: برداشت مستقیم از محصول بیولوژیک یا محیط کشت سلولی (حاوی سوپرناتانت و سلولها).
تلقيح اولیه: افزودن نمونه به لوله براث و انکوباسیون در دمای 35–37°C، معمولاً با 5–10% CO₂، به مدت 3–14 روز.
انتقال به آگار: در فواصل مشخص (معمولاً روزهای 3، 7 و 14) بخشی از براث به محیط آگار اختصاصی منتقل میشود.
بررسی کلنیها: مشاهده صفحات آگار با میکروسکوپ فازکنتراست (100–400×) برای شناسایی کلنیهای مشخص مایکوپلاسما با شکل «تخممرغ نیمپز».
تأیید هویت: در صورت نیاز با آزمونهای بیوشیمیایی (مانند هیدرولیز آرژنین یا تخمیر گلوکز) یا روش مولکولی.
این روش زنده بودن عامل را تأیید میکند اما زمانبر است و نیاز به تخصص میکروسکوپی دارد.
روش تقویت اسید نوکلئیک (Nucleic Acid Amplification Techniques – NAAT)
این روش بر اساس شناسایی DNA اختصاصی مایکوپلاسما طراحی شده و معمولاً شامل PCR یا Real-Time PCR است.
اصول:
- هدف قرار دادن ژنهای محافظهکار مانند 16S rRNA یا ژنهای اختصاصی گونه.
- امکان شناسایی گونههای زنده و مرده.
مراحل انجام طبق <USP 63>
استخراج DNA: از نمونه بیولوژیک با کیت یا روش معتبر، همراه با کنترل کیفیت استخراج (کنترل داخلی).
آمادهسازی واکنش PCR: استفاده از پرایمر و پروب اختصاصی، با کنترل مثبت و منفی.
چرخه تکثیر: شامل دناتوراسیون (۹۴–۹۵°C)، اتصال پرایمر (۵۰–۶۰°C)، و کشش (۷۲°C)، در ۳۰–۴۰ چرخه.
آشکارسازی:
- در PCR معمولی: الکتروفورز ژل آگارز و مشاهده باند DNA.
- در qPCR: اندازهگیری سیگنال فلورسانس در طول واکنش.
تفسیر نتایج: مقایسه سیگنال با کنترلها؛ نمونه مثبت با سیگنال یا باند اختصاصی مشخص میشود.
این روش سریع، حساس و بسیار اختصاصی است، اما قادر به تمایز بین مایکوپلاسما زنده و مرده نیست و مستعد آلودگی DNA میباشد.
جدول مقایسه دو روش
| ویژگی | روش کشت (Culture Method) | روش NAAT (PCR/qPCR) |
|---|---|---|
| نوع هدف | مایکوپلاسما زنده | DNA مایکوپلاسما (زنده یا مرده) |
| حساسیت | بالا برای ارگانیسم زنده | بسیار بالا، حتی در مقادیر بسیار کم DNA |
| اختصاصیت | بالا، اما وابسته به مهارت اپراتور | بسیار بالا با طراحی مناسب پرایمر |
| زمان پاسخدهی | 7 تا 28 روز | 4 تا 8 ساعت |
| تجهیزات مورد نیاز | انکوباتور CO₂، میکروسکوپ فازکنتراست، محیط اختصاصی | ترموسایکلر، سیستم qPCR، تجهیزات استخراج DNA |
| کنترل آلودگی | نسبتاً ساده (کنترل محیطی) | بسیار حساس به آلودگی مولکولی |
| مزایا | روش مرجع، تأیید زنده بودن عامل | سرعت و حساسیت بالا، تشخیص سریع |
| محدودیتها | زمانبر، نیاز به مهارت زیاد | عدم تمایز بین زنده و مرده، حساس به آلودگی DNA |
سوالات متداول
آیا روش NAAT (PCR) میتواند جایگزین کامل روش کشت در آزمون مایکوپلاسما شود؟ بسته به نهاد نظارتی و نوع محصول، بله ممکن است. با این حال برای برخی پروندههای ثبت محصول، همچنان روش کشت بهعنوان استاندارد طلایی درخواست میشود..
آزمون مایکوپلاسما در چه مرحلهای از تولید محصولات بیولوژیک انجام میشود؟ معمولاً در چند نقطه کنترلی: هنگام تأیید بانک سلولی اصلی و کاری، در طول فرآیند تولید (Harvest) و پیش از فرمولاسیون نهایی محصول.
نتیجهگیری
آزمایشگاه همکار نیکوفارمد، بهعنوان یکی از مراکز پیشرو در ارائه خدمات آزمایشگاهی، آزمون مایکوپلاسما را با بهرهگیری از روشهای کشت اختصاصی، سلول اندیکاتور و PCR انجام میدهد. نیکوفارمد با استفاده از تجهیزات مدرن، محیطهای کشت استاندارد و تیمی متخصص، قادر به شناسایی سریع و دقیق آلودگیهای مایکوپلاسما در نمونههای بالینی و کشتهای سلولی است.
رعایت استانداردهای بینالمللی (USP <63>، EP 2.6.7)، تضمین دقت نتایج و ارائه خدمات قابلاعتماد، از ویژگیهای برجسته این مرکز برای محققان، صنایع داروسازی و آزمایشگاههای مرتبط است.