روش های آزمون سمیت ژنی

روش های آزمون سمیت ژنی

آزمون سمیت ژنی (Genotoxicity Testing) برای ارزیابی اثرات مضر مواد شیمیایی، داروها، یا سایر عوامل بر DNA و ماده ژنتیکی سلول‌ها انجام می‌شود. این آزمون‌ها به‌ویژه برای شناسایی موادی که ممکن است باعث جهش ژنتیکی، آسیب DNA یا ناهنجاری‌های کروموزومی شوند، اهمیت دارند.

روش های آزمون سمیت ژنی شامل Ames ، HPRT، Comet Assay است.

جهت دریافت خدمات و مشاوره رایگان با نیکوفامد تماس بگیرید.

انواع روش های آزمون سمیت ژنی

آزمون سمیت ژنی Ames

آزمون Ames یکی از روش‌های پایه‌ای و استاندارد برای ارزیابی خاصیت جهش‌زایی (Mutagenicity) مواد شیمیایی است. این روش توسط دکتر بروس امز در دهه 1970 توسعه یافت و به‌عنوان یکی از آزمون‌های اولیه برای شناسایی پتانسیل مواد سرطان‌زا مورد استفاده قرار می‌گیرد. در این آزمون از باکتری‌های جهش‌یافته استفاده می‌شود که توانایی آن‌ها برای سنتز یک اسید آمینه خاص مختل شده است. آزمون Ames در واقع تأثیر مواد شیمیایی بر ایجاد جهش بازگشتی (Reversion Mutation) در ژنوم این باکتری‌ها را بررسی می‌کند.

اساس علمی آزمون Ames

این آزمون بر اساس استفاده از سویه‌های جهش‌یافته باکتریایی طراحی شده است. این باکتری‌ها در مسیر متابولیکی سنتز اسید آمینه‌ای مانند هیستیدین (His) یا تریپتوفان (Trp) جهش یافته‌اند و بدون وجود این اسیدهای آمینه در محیط نمی‌توانند رشد کنند.

اگر یک ماده شیمیایی خاص باعث جهش بازگشتی در ژن‌های جهش‌یافته این باکتری‌ها شود، توانایی آن‌ها برای رشد مجدد بازیابی شده و کلنی‌هایی روی محیط کشت ظاهر خواهند شد.

سویه‌های باکتری مورد استفاده آزمون Ames

Salmonella typhimurium: سویه‌هایی که در مسیر سنتز هیستیدین جهش یافته‌اند.

Escherichia coli: سویه‌هایی که در مسیر سنتز تریپتوفان جهش یافته‌اند.

این سویه‌ها ویژگی‌های زیر را دارند:

جهش‌یافته بودن در ژن‌هایی که آن‌ها را وابسته به یک ماده مغذی خاص (مانند هیستیدین) می‌کند.

نفوذپذیری بیشتر دیواره سلولی به دلیل جهش در ژن‌های مربوط به لیپوپلی‌ساکاریدها، که ورود مواد شیمیایی را تسهیل می‌کند.

نقص در مکانیسم‌های ترمیم DNA (مانند نقص در سیستم excision repair)، که حساسیت باکتری به جهش را افزایش می‌دهد.

مراحل اجرای آزمون Ames

آماده‌سازی محیط کشت

باکتری‌های جهش‌یافته روی محیط آگار که تنها حاوی مقادیر محدودی هیستیدین یا تریپتوفان است کشت داده می‌شوند.

افزودن ماده مورد آزمایش

ماده شیمیایی مورد آزمایش به مرکز محیط کشت اضافه می‌شود.

در برخی موارد، برای فعال‌سازی متابولیکی، از S9 mix استفاده می‌شود.

S9 mix: عصاره کبدی حیوانات (معمولاً موش) که شامل آنزیم‌های متابولیکی است و شبیه‌سازی شرایط بدن را امکان‌پذیر می‌کند.

انکوباسیون

صفحات کشت در دمای مناسب (معمولاً 37 درجه سانتی‌گراد) انکوبه می‌شوند تا رشد کلنی‌ها آغاز شود.

تفسیر نتایج

تعداد کلنی‌های رشد کرده شمارش می‌شوند.

افزایش تعداد کلنی‌ها در مقایسه با کنترل منفی نشان‌دهنده جهش بازگشتی است و به معنای جهش‌زا بودن ماده است.

کنترل مثبت برای تأیید کارایی آزمون استفاده می‌شود.

کنترل‌های آزمون Ames

کنترل مثبت: ماده‌ای با خاصیت جهش‌زایی شناخته‌شده برای اطمینان از عملکرد صحیح آزمون.

کنترل منفی: محیط کشت بدون حضور ماده شیمیایی، برای بررسی رشد طبیعی.

کنترل با S9 mix: برای بررسی مواد نیازمند متابولیسم.

آزمون Ames یکی از پایه‌ای‌ترین و قابل‌اعتمادترین ابزارها در بررسی سمیت ژنی و شناسایی مواد جهش‌زا است. این آزمون با استفاده از سویه‌های باکتریایی و محیط‌های کنترل‌شده، به دانشمندان اجازه می‌دهد خطرات بالقوه مواد شیمیایی را به‌طور سریع و اقتصادی ارزیابی کنند. اگرچه این روش دارای محدودیت‌هایی است، اما همچنان به‌عنوان یکی از مهم‌ترین ابزارهای ارزیابی اولیه در تحقیقات سمیت ژنی شناخته می‌شود.

انواع روش های آزمون سمیت ژنی

برای آشنایی با آزمون سمیت ژنی کلیک کنید.

آزمون سمیت ژنی Comet Assay

Comet Assay یکی از روش‌های حساس و قدرتمند برای ارزیابی آسیب DNA در سلول‌های یوکاریوتی است. این آزمون که با نام علمی Single Cell Gel Electrophoresis (SCGE) نیز شناخته می‌شود، آسیب‌های ژنتیکی نظیر شکستگی‌های تک‌رشته‌ای (Single-Strand Breaks)، شکستگی‌های دو‌رشته‌ای (Double-Strand Breaks)، آسیب‌های قلیایی به DNA و اختلالات بازهای نیتروژنی را شناسایی می‌کند.

این آزمون به‌دلیل حساسیت بالا، سرعت و امکان استفاده از انواع سلول‌ها (مانند سلول‌های خون محیطی، بافت‌ها یا سلول‌های کشت‌شده) به‌طور گسترده در مطالعات سمیت ژنی، تحقیقات سرطان‌شناسی و ارزیابی ریسک محیطی مورد استفاده قرار می‌گیرد.

اساس علمی آزمون

در آزمون Comet Assay، سلول‌های آسیب‌دیده با استفاده از الکتروفورز ژل تجزیه می‌شوند. قطعات آسیب‌دیده DNA به دلیل وزن مولکولی پایین‌تر، در میدان الکتریکی سریع‌تر حرکت کرده و الگویی شبیه به دم دنباله‌دار یک ستاره دنباله‌دار (Comet) ایجاد می‌کنند. طول و شدت این دم نشان‌دهنده میزان آسیب DNA است.

مراحل اجرای آزمون Comet Assay

 آماده‌سازی سلول‌ها

سلول‌های مورد نظر (مانند سلول‌های خون محیطی، مغز استخوان، یا سلول‌های کشت‌شده) جمع‌آوری می‌شوند.

سلول‌ها با استفاده از بافر مناسب (معمولاً PBS) شسته می‌شوند تا از آلودگی‌های خارجی پاک شوند.

کپسوله کردن سلول‌ها در ژل آگاروز

سلول‌ها در ژل آگاروز ذوب‌شده و دمای پایین (حدود 37 درجه سانتی‌گراد) قرار می‌گیرند و روی اسلاید شیشه‌ای تثبیت می‌شوند.

این مرحله باعث حفظ موقعیت مکانی سلول‌ها می‌شود.

 لیز کردن سلول‌ها

اسلایدها در محلول لیز کننده (معمولاً حاوی دترجنت‌ها و نمک‌های قوی مانند NaCl) قرار می‌گیرند تا غشاهای سلولی و هسته‌ای تخریب شوند و DNA آزاد شود.

این مرحله معمولاً در دمای پایین (4 درجه سانتی‌گراد) انجام می‌شود تا از تخریب بیشتر DNA جلوگیری شود.

الکتروفورز

اسلایدها در تانک الکتروفورز قرار می‌گیرند.

بسته به نوع آسیب مورد نظر، الکتروفورز قلیایی (برای شناسایی شکستگی‌های تک‌رشته‌ای و دو‌رشته‌ای) یا الکتروفورز خنثی (برای شکستگی‌های دو‌رشته‌ای) انجام می‌شود.

قطعات کوچک‌تر DNA به سمت قطب مثبت حرکت کرده و الگویی شبیه به دم ایجاد می‌کنند.

 رنگ‌آمیزی و مشاهده

DNA با استفاده از رنگ‌های فلورسانس (مانند Ethidium Bromide یا SYBR Green) رنگ‌آمیزی می‌شود.

اسلایدها زیر میکروسکوپ فلورسانس یا سیستم‌های تصویربرداری پیشرفته مشاهده و تحلیل می‌شوند.

تحلیل داده‌ها

میزان آسیب DNA با استفاده از پارامترهایی مانند:

طول دم (Tail Length): فاصله‌ای که DNA از مرکز سلول حرکت کرده است.

درصد DNA دم (Tail DNA %): درصد DNA موجود در دم نسبت به کل DNA.

لحظه دم (Tail Moment): ترکیبی از طول دم و شدت فلورسانس.

این پارامترها میزان و شدت آسیب DNA را نشان می‌دهند.

انواع آسیب‌هایی که در Comet Assay شناسایی می‌شود

شکستگی‌های تک‌رشته‌ای (SSBs): آسیب به یکی از رشته‌های DNA.

شکستگی‌های دو‌رشته‌ای (DSBs): آسیب به هر دو رشته DNA، که خطرناک‌تر است.

محل‌های حساس به قلیا: بازهای آسیب‌دیده که در شرایط قلیایی شکسته می‌شوند.

تشکیل پیوندهای عرضی (Crosslinks): اختلالات ساختاری بین مولکول‌های DNA و پروتئین.

Comet Assay یک ابزار قدرتمند و حساس برای شناسایی آسیب‌های ژنتیکی در سطح سلولی است. این روش به‌دلیل تطبیق‌پذیری بالا، در حوزه‌های مختلف زیست‌شناسی، سمیت ژنی و تحقیقات سرطان‌شناسی کاربرد دارد. اگرچه محدودیت‌هایی وجود دارد، اما به‌دلیل سرعت، دقت و قابلیت انجام روی طیف وسیعی از سلول‌ها، این آزمون همچنان یکی از انتخاب‌های اصلی در ارزیابی آسیب DNA محسوب می‌شود.

آزمون سمیت ژنی HPRT

آزمون HPRT (Hypoxanthine-guanine Phosphoribosyltransferase) یکی از روش‌های کلیدی برای ارزیابی سمیت ژنی و شناسایی مواد جهش‌زا در سلول‌های پستانداران است. این آزمون به‌ویژه برای شناسایی جهش‌های ژنی در سطح ژن‌های قابل انتخاب (Selectable Genes) استفاده می‌شود و به‌عنوان یک ابزار استاندارد در غربالگری مواد شیمیایی، دارویی و محیطی مورد استفاده قرار می‌گیرد.

ژن HPRT کدکننده آنزیمی است که در مسیر نجات بازهای پورینی (Purine Salvage Pathway) نقش دارد. جهش در این ژن باعث تغییر عملکرد آنزیم می‌شود و سلول‌های جهش‌یافته نسبت به داروهای خاصی مقاوم می‌شوند، که این مقاومت به‌عنوان معیاری برای شناسایی جهش‌ها در سلول‌های آزمایشگاهی مورد استفاده قرار می‌گیرد.

هدف از آزمون HPRT

  • شناسایی جهش‌های نقطه‌ای (Point Mutations) یا حذف‌های کوچک (Small Deletions) در ژنوم سلول‌های پستانداران.
  • ارزیابی پتانسیل جهش‌زایی مواد شیمیایی، داروها یا عوامل محیطی.
  • مطالعه مکانیسم‌های ژنتیکی دخیل در سرطان‌زایی و ترمیم DNA.

اساس علمی آزمون HPRT

ژن HPRT در سلول‌های پستانداران وظیفه کد کردن آنزیم هیپوگزانتین-گوانین فسفوریبوزیل‌ترانسفراز را بر عهده دارد. این آنزیم در مسیر نجات بازهای پورینی برای تولید گوانوزین مونوفسفات (GMP) و اینوزین مونوفسفات (IMP) نقش دارد.

جهش در ژن HPRT باعث غیر‌فعال شدن این مسیر می‌شود.

سلول‌های جهش‌یافته در محیط حاوی 6-تیوگزانتین (6-TG) زنده می‌مانند، زیرا آنزیم HPRT نمی‌تواند این ترکیب را متابولیزه کرده و به یک ماده سمی تبدیل کند.

مراحل اجرای آزمون HPRT

 انتخاب سلول‌ها

معمولاً از سلول‌های پستانداران مانند سلول‌های لنفوسیتی انسان (Human Lymphocytes) یا سلول‌های کشت‌شده حیوانی (مانند CHO یا V79) استفاده می‌شود.

 آماده‌سازی محیط کشت

سلول‌ها در محیط کشت غنی‌شده با مواد مغذی مورد نیاز رشد داده می‌شوند.

تیوگزانتین6- (6-TG): یک عامل انتخابی که سلول‌های جهش‌یافته مقاوم به آن را از سلول‌های طبیعی متمایز می‌کند.

 افزودن ماده مورد آزمایش

سلول‌ها با ماده شیمیایی یا داروی مورد نظر تیمار می‌شوند.

در صورت وجود خاصیت جهش‌زایی، ماده باعث جهش در ژن HPRT خواهد شد.

 انتخاب سلول‌های جهش‌یافته

سلول‌ها در محیط حاوی 6-TG کشت داده می‌شوند.

تنها سلول‌هایی که ژن HPRT آن‌ها جهش‌یافته و غیر‌فعال شده است قادر به زنده ماندن خواهند بود.

شمارش کلنی‌ها

کلنی‌های زنده‌شده سلول‌های جهش‌یافته شمارش می‌شوند. تعداد کلنی‌ها به میزان جهش‌زایی ماده مورد نظر وابسته است.

کنترل‌های آزمون HPRT

کنترل مثبت

از مواد شناخته‌شده با خاصیت جهش‌زایی (مانند MMS یا ENU) استفاده می‌شود تا صحت و کارایی آزمون تأیید شود.

کنترل منفی

محیط کشت بدون ماده جهش‌زا برای تعیین نرخ پایه جهش در سلول‌ها.

انواع جهش‌هایی که در آزمون HPRT شناسایی می‌شود

  • جهش‌های نقطه‌ای (Point Mutations): تغییر در یک باز نیتروژنی خاص.
  • حذف‌های کوچک (Small Deletions): حذف چندین باز نیتروژنی در ژن HPRT.
  • تغییرات در محل‌های حساس به قلیا: آسیب‌هایی که بر ساختار بازهای نیتروژنی اثر می‌گذارند.

آزمون HPRT یکی از روش‌های استاندارد و قابل‌اعتماد برای ارزیابی سمیت ژنی و شناسایی مواد جهش‌زا است. این روش با استفاده از ویژگی‌های ژن HPRT و مقاومت سلول‌ها به 6-TG، امکان شناسایی دقیق جهش‌های ژنتیکی را فراهم می‌کند. اگرچه محدودیت‌هایی نظیر زمان‌بر بودن و تمرکز بر یک ژن خاص دارد، اما به‌دلیل حساسیت بالا و کاربرد گسترده، یکی از ابزارهای کلیدی در تحقیقات سمیت ژنی و سرطان‌شناسی محسوب می‌شود.