آزمون اندوتوکسین چیست؟
آزمون اندوتوکسین که برای شناسایی و اندازه‌گیری سموم حاصل از باکتری‌های گرم‌منفی در داروها، فرآورده‌های بیولوژیک و تجهیزات پزشکی انجام می‌شود. محصولاتی که با خون یا مایعات بدن تماس دارند. این آزمون بر پایه واکنش شیمیایی بین اندوتوکسین و لیزات آمیبوسیت خرچنگ نعل‌اسبی (Limulus Amebocyte Lysate – LAL) انجام می‌شود و با سه روش اصلی ژل‌کلاتی، توربیدیمتری و کروموژنیک انجام می شود.
طبق استاندارد <USP 85> چگونگی انتخاب روش مناسب،تعیین حساسیت لیزات و حد مجاز اندوتوکسین تعیین می شود و آزمون‌های کنترل کیفیت انجام گیرد تا اطمینان حاصل شود محصول نهایی از نظر ایمنی با قوانین و استانداردهای بین‌المللی مطابقت دارد.
جهت دریافت خدمات و مشاوره رایگان با نیکوفامد تماس بگیرید.
انواع روش های آزمون اندوتوکسین
تست LAL (Limulus Amebocyte Lysate) به عنوان یکی از روش‌های استاندارد برای سنجش اندوتوکسین‌ها در محصولات دارویی و بیولوژیکی شناخته شده است. این تست از سه روش مختلف برای تشخیص و اندازه‌گیری اندوتوکسین‌ها استفاده می‌کند که به شرح زیر است:
1.روش ژل کلات (Gel-clot method)
این روش مبتنی بر توانایی اندوتوکسین برای فعال کردن عامل پروتئینی در LAL است که منجر به تشکیل ژل می‌شود. نمونه به لیزات امبوسیت لیمولوس اضافه می‌شود و در صورت وجود اندوتوکسین، محلول به ژل تبدیل می‌شود. این واکنش نشان‌دهنده حضور اندوتوکسین در نمونه است. روش ژل کلات به دلیل سادگی و هزینه کم، بسیار محبوب است اما حساسیت آن کمتر از دیگر روش‌های LAL است.
2. روش کروموژنیک (Chromogenic method)
روش کروموژنیک بر پایه تغییر رنگ ناشی از واکنش بین اندوتوکسین و یک سوبسترا کروموژنیک خاص است. در این روش، اندوتوکسین‌ها باعث فعال‌سازی یک زنجیره انزیمی در LAL می‌شوند که نهایتاً به تولید رنگ منجر می‌شود. این رنگ می‌تواند به طور کمی با استفاده از اسپکتروفتومتر اندازه‌گیری شود. روش کروموژنیک برای تعیین مقادیر کم اندوتوکسین مناسب است و دقت بالایی دارد.
3. روش کدورت سنجی (Turbidimetric method)
در روش کدورت‌سنجی، میزان کدورت نمونه‌ای که به آن LAL اضافه شده، اندازه‌گیری می‌شود. این کدورت ناشی از تشکیل پیچیده‌های ناپایدار بین اندوتوکسین و عوامل درون LAL است. میزان کدورت با استفاده از نفوذ نور و اندازه‌گیری میزان نوری که از نمونه عبور می‌کند، سنجیده می‌شود. این روش برای سنجش سریع و دقیق اندوتوکسین در محدوده‌های گسترده‌ای از غلظت‌ها مناسب است.
هر یک از این روش‌ها بسته به نوع نمونه و دقت مورد نیاز در تشخیص اندوتوکسین می‌تواند استفاده شود. انتخاب روش مناسب بر اساس نیاز خاص تست و شرایط آزمایشگاهی تعیین می‌گردد.
جهت آشنایی با آزمون های میکروبی کلیک کنید.
استاندارد آزمون اندوتوکسین
آزمایشگاه همکار نیکوفارمد با بهره‌گیری از تجهیزات پیشرفته و نیروی متخصص، آزمون اندوتوکسین را به‌صورت تخصصی و مطابق با آخرین الزامات بین‌المللی و ملی انجام می‌دهد. این آزمایشگاه، آزمون اندوتوکسین فرآورده‌های دارویی را براساس استاندارد معتبر USP 85 (آزمایش اندوتوکسین با روش LAL) انجام می‌دهد که یکی از مهم‌ترین مراجع علمی در صنعت داروسازی برای ارزیابی ایمنی تزریقات و فرآورده‌های استریل به‌شمار می‌رود.
همچنین، در حوزه تجهیزات پزشکی، آزمون اندوتوکسین توسط نیکوفارمد مطابق با استاندارد ملی ایران INSO 10572 انجام می‌شود؛ این استاندارد با بهره‌گیری از اصول روش USP 85 و انطباق با الزامات تجهیزات پزشکی، چارچوب دقیق و اطمینان‌بخشی برای کنترل اندوتوکسین در وسایل و محصولات پزشکی فراهم می‌کند.
مراحل انجام تست اندوتوکسین
آزمون اندوتوکسین طبق <USP 85> بر پایه واکنش اختصاصی اندوتوکسین‌های گرم‌منفی با لیزات آمیبوسیت خرچنگ نعل‌اسبی (LAL) انجام می‌شود و اجرای آن با چند گام کلیدی و سه قالب اندازه‌گیری است:
ابتدا حد مجاز اندوتوکسین (EL) با فرمول EL = K/M محاسبه می‌شود (به‌طور معمول K = 5 EU/kg برای فرآورده‌های تزریقی غیراینتراتکال و K = 0.2 EU/kg برای فرآورده‌های اینتراتکال؛ سایر مسیرها بر اساس فصل‌های مربوط محاسبه می‌شوند) و سپس بیشترین رقت معتبر (MVD) از رابطه MVD = (EL × C)/λ تعیین می‌گردد که در آن λ حساسیت لیزات و C ضریب غلظت/استخراج نمونه است.
آماده‌سازی شامل به‌کارگیری آب اختصاصی LAL (LRW)، شیشه‌آلات دپیروژن‌شده، تنظیم pH در محدوده ۶–۸ و انجام آزمون مداخله (Suitability) با نمونه‌های اسپایک‌شده با اندوتوکسین استاندارد مرجع (RSE/CSE) است تا بازیابی قابل‌قبول (معمولاً ۵۰–۲۰۰٪) و نبود مهار/تقویت تأیید شود؛ در صورت تداخلِ β-گلوکان‌ها، از لیزات‌های غیروحساس به گلوکان یا بافرهای مهارگر استفاده می‌شود. سپس یکی از سه روش اجرا می‌گردد:
ژل‌کلات (Gel-Clot)
آزمونی کیفی/نیمه‌کمی با مخلوط کردن حجم برابر نمونه/استاندارد و لیزات، انکوباسیون در ۳۷±۱°C به‌مدت ۶۰±۲ دقیقه و خوانش با وارونه‌سازی ۱۸۰ درجه؛ تشکیل ژل پایدار «مثبت» تلقی شده و با سری رقت‌ها حد آستانه در EU/mL تعیین می‌شود که باید با λ لیزات هم‌خوان باشد.
توربیدیمتری (Turbidimetric)
آزمون کمی (اندپوینت یا کینتیک) که در آن افزایش کدورت در طول زمان توسط ریدر نوری ثبت و بر اساس منحنی استاندارد چندنقطه‌ای (دامنه‌ای که λ را پوشش دهد) به EU/mL تبدیل می‌شود؛ معیارهای پذیرش شامل خطی بودن رگرسیون در مقیاس لگاریتمی، تکرارپذیری بین تکرارها و صحت بازیابی PPCها است.
کروموژنیک (Chromogenic)
آزمون کمی (اندپوینت یا کینتیک) مبتنی بر فعال‌سازی آبشاری LAL و آزادسازی کروموفور از سوبسترا؛ جذب معمولاً در ۴۰۵ نانومتر خوانده و با منحنی استاندارد به EU/mL محاسبه می‌شود؛ کنترل‌های مثبت/منفی و PPCها الزامی‌اند و معیارهای خطیّت/دقت مشابه توربیدیمتری اعمال می‌شود.
در پایان، نتایج با اعمال ضرایب رقت و استخراج به واحد مناسب (EU/mL، EU/دوز یا EU/دستگاه) گزارش و با EL مقایسه می‌شود؛ هر عدم انطباق با EL یا معیارهای کیفی (مانند خطی نبودن استانداردها، بازیابی نامناسب یا کالیبراسیون دمایی نامعتبر) موجب رد آزمون/نمونه و لزوم تکرار با رفع علت می‌گردد. این الزامات به‌همراه مستندسازی کاملِ شماره سری لیزات و CSE، λ، منحنی‌ها، دما/زمان انکوباسیون و سوابق کالیبراسیون تجهیزات، چارچوب اجرای معتبر و قابل بازرسی آزمون را طبق <USP 85> تشکیل می‌دهند.
مکانیزم ایجاد تب در تست اندوتوکسین
مکانیسم ایجاد تب در آزمون اندوتوکسین طبق USP <85> بر اساس اثر پیرُوژنیک اندوتوکسین‌های لیپوپلی‌ساکاریدی (LPS) باکتری‌های گرم‌منفی است که در صورت ورود به جریان خون، یک آبشار ایمنی ـ التهابی مشخص را فعال می‌کنند. پس از ورود اندوتوکسین به بدن، این مولکول توسط پروتئین باندکننده LPS (LBP) به کمپلکس گیرنده‌ای CD14–MD-2–TLR4 روی سطح مونوسیت‌ها و ماکروفاژها متصل می‌شود.
فعال‌سازی TLR4 باعث راه‌اندازی مسیرهای پیام‌رسانی داخل سلولی مانند NF-κB و MAPK می‌گردد که در نهایت منجر به ترشح پیرُوژن‌های درون‌زاد شامل اینترلوکین-۱β (IL-1β)، اینترلوکین-۶ (IL-6) و TNF-α می‌شود. این سیتوکین‌ها از طریق گردش خون به هیپوتالاموس قدامی رسیده و آنزیم سیکلو‌اکسیژناز-۲ (COX-2) را در سلول‌های اندوتلیال عروق مغزی فعال می‌کنند، که حاصل آن افزایش تولید پروستاگلاندین E₂ (PGE₂) است. PGE₂ با اتصال به گیرنده EP3 در نورون‌های مرکز تنظیم دما، نقطه تنظیم حرارت (set point) را بالاتر می‌برد و پاسخ‌های فیزیولوژیک مانند لرزش عضلانی، انقباض عروق محیطی و افزایش متابولیسم را فعال می‌کند که در مجموع باعث بروز تب می‌شود.
در آزمون <USP 85> خودِ افزایش دما اندازه‌گیری نمی‌شود، بلکه با استفاده از واکنش اختصاصی LAL با بخش لیپید A در ساختار LPS، همان جزء مولکولی‌ای که محرک اولیه آبشار تب است، شناسایی و کمی‌سازی می‌گردد. این رویکرد با حذف آزمون حیوانی سنتی (Rabbit Pyrogen Test) امکان ارزیابی حساس، سریع و استاندارد پتانسیل تب‌زایی فرآورده را فراهم می‌کند و به همین دلیل امروزه به‌عنوان مرجع اصلی کنترل اندوتوکسین در محصولات دارویی و پزشکی به کار می‌رود.
تفاوت‌های تست اندوتوکسین و تست تب‌زایی درون‌تنی در خرگوش
| معیار | تست تب‌زایی درون‌تنی خرگوش (Rabbit Pyrogen Test) | تست تب‌زایی برون‌تنی LAL (Limulus Amebocyte Lysate) |
|---|---|---|
| نوع تست | بیولوژیک درون‌تنی (In Vivo) | بیوشیمیایی برون‌تنی (In Vitro) |
| نمونه آزمایشی | خرگوش زنده | لیزات سلول‌های آمیبوسیت خرچنگ نعل اسبی (Limulus) |
| نوع پیروژن قابل شناسایی | همه انواع پیروژن‌ها (اندوتوکسین، اگزوتوکسین، باقی‌مانده‌های سلولی و…) | فقط اندوتوکسین‌های باکتری‌های گرم منفی |
| حساسیت | کمتر از LAL (وابسته به دوز و پاسخ بیولوژیک حیوان) | بسیار بالا (حتی مقادیر پیکوگرم اندوتوکسین را شناسایی می‌کند) |
| معیار ارزیابی | افزایش دمای بدن خرگوش (بیش از 0.5 درجه سانتی‌گراد) | ایجاد ژل یا کدورت در لیزات بر اثر وجود اندوتوکسین |
| مدت زمان انجام | معمولاً ۳ تا ۵ ساعت (گاهی بیشتر با دوره‌های پیش‌آزمایی) | حدود ۳۰ تا ۶۰ دقیقه |
| هزینه و منابع | پرهزینه، نیازمند مراقبت حیوانات زنده، محیط کنترل‌شده | کم‌هزینه‌تر، بدون نیاز به حیوان زنده |
| محدودیت‌های قانونی و اخلاقی | محدودیت‌های اخلاقی به دلیل استفاده از حیوانات | فاقد محدودیت‌های اخلاقی حیوانی |
| کاربرد رایج | محصولات پیچیده یا مشکوک به پیروژن‌های غیراندوتوکسینی | محصولات تزریقی، داروها و تجهیزات پزشکی فاقد پیروژن‌های غیراندوتوکسینی |
نکات مهم
یکی از اصلی‌ترین تفاوت‌ها این است که تست تب‌زایی خرگوش توانایی شناسایی تمامی انواع پیروژن‌ها را دارد، اما تست LAL تنها مختص اندوتوکسین‌های گرم منفی است. بنابراین برای محصولاتی که احتمال وجود پیروژن‌های غیراندوتوکسینی (مانند اگزوتوکسین‌های باکتری‌های گرم مثبت یا باقی‌مانده‌های قارچی) در آن‌ها هست، تست خرگوش همچنان انتخاب الزامی است.
با پیشرفت روش‌های برون‌تنی و قوانین حمایت از حیوانات، تست LAL تا حد زیادی جایگزین تست تب‌زایی خرگوش شده است؛ اما در محصولاتی با ترکیبات پیچیده یا مشکوک به حضور انواع مختلف پیروژن‌ها، آزمون خرگوش هنوز مرجع نهایی است.
برای داروها و تجهیزات تزریقی ساده تست LAL کافی است.
برای فرآورده‌های بیولوژیک پیچیده یا محصولاتی با ترکیبات ناشناخته انجام تست تب‌زایی خرگوش توصیه می‌شود یا ترکیب هر دو تست جهت پوشش کامل خطرات.
جهت آشنایی با آزمون استریلیتی کلیک کنید.
فرایند های جلوگیری از ایجاد آلودگی اندوتوکسین
جلوگیری از آلودگی اندوتوکسین در محصولات بیولوژیکی و دارویی نیازمند یک سری فرایندهای دقیق و منظم است که شامل کنترل‌های محیطی، استریلیزاسیون، فرایندهای تولید، و آزمایش‌های مکرر می‌شود. در ادامه، به بررسی فرایندهای کلیدی برای جلوگیری از این نوع آلودگی پرداخته‌ایم.
کنترل‌های محیطی
حفظ محیط تولید به صورت استریل و تمیز از اهمیت بالایی برخوردار است. استفاده از مواد ضدعفونی‌کننده مؤثر و اطمینان از تمیزکاری دوره‌ای محیط می‌تواند در کاهش خطر آلودگی ناخواسته کمک کند.
محدود کردن دسترسی به مناطق تولید تنها به افراد آموزش دیده و مجاز و استفاده از لباس‌های مناسب برای جلوگیری از ورود آلاینده‌ها از محیط خارج.
استریلیزاسیون مواد و تجهیزات
استریلیزاسیون با استفاده از حرارت مرطوب یا خشک برای حذف هرگونه آلاینده بیولوژیکی که ممکن است حاوی اندوتوکسین باشد.
استفاده از فیلترهای با قابلیت جذب بالا برای حذف ذرات و میکروب‌ها از مواد اولیه قبل از ورود به فرایند تولید.
کنترل فرایندهای تولید
تولید در شرایط کاملاً استریل برای جلوگیری از هرگونه آلودگی میکروبی و غیرمیکروبی، به خصوص در مراحل حساس فرایند.
نظارت و کنترل دقیق بر شرایط فرایند، مانند pH و دما، که می‌تواند بر رشد باکتری‌های گرم منفی تأثیر بگذارد و از تشکیل اندوتوکسین‌ها جلوگیری کند.
آزمایش و بازرسی محصولات
انجام تست‌های منظم LAL برای اطمینان از عدم وجود اندوتوکسین در محصولات نهایی. این تست‌ها باید به صورت دوره‌ای و بر اساس دستورالعمل‌های استاندارد انجام شوند.
بررسی نمونه‌هایی از محصولات در مراحل مختلف تولید برای اطمینان از عدم وجود آلودگی و رعایت استانداردهای کیفی.
آموزش و پرورش کارکنان
برگزاری دوره‌های آموزشی برای کارکنان در مورد اهمیت رعایت اصول آسپتیک، شناسایی خطرات اندوتوکسین و روش‌های پیشگیری از آلودگی.
این فرایندها، زمانی که به درستی و با دقت اجرا شوند، می‌توانند به طور مؤثری خطر آلودگی اندوتوکسین را در محصولات بیولوژیکی کاهش دهند و ایمنی و کیفیت بالای محصولات را تضمین کنند.
آزمایشگاه همکار نیکوفارمد، با بهره‌گیری از کادری مجرب و تجهیزات پیشرفته، خدمات تخصصی در زمینه انجام تست اندوتوکسین را ارائه می‌دهد. این تست، که به منظور تعیین میزان اندوتوکسین‌ها در محصولات پزشکی و دارویی صورت می‌پذیرد، نقش کلیدی در تضمین ایمنی و سلامت محصولات ارائه شده دارد. تعهد آزمایشگاه به استفاده از فناوری‌های به روز و نیروی انسانی کارآمد، اطمینان از رعایت دقیق‌ترین استانداردهای بین‌المللی را ممکن ساخته و به پیشبرد اهداف کیفی شرکت نیکوفارمد در راستای ارتقاء سطح سلامت جامعه کمک شایانی می‌نماید.