کروماتوگرافی چیست؟

کروماتوگرافی یکی از مهم‌ترین روش‌های آنالیز آزمایشگاهی است که برای جداسازی، شناسایی و اندازه‌گیری ترکیبات موجود در یک مخلوط به کار می‌رود. این تکنیک تحلیلی از اوایل قرن بیستم معرفی شد و با وجود پیشرفت‌های گسترده در علم آنالیز، همچنان به‌عنوان یکی از دقیق‌ترین و قابل‌اعتمادترین روش‌ها در آزمایشگاه‌های کنترل کیفیت، دارویی، غذایی و تحقیقاتی مورد استفاده قرار می‌گیرد.
دلیل ماندگاری و محبوبیت این روش، دقت بالا، تکرارپذیری نتایج و قابلیت تطبیق با انواع نمونه‌ها است. امروزه چهار نوع اصلی کروماتوگرافی عبارت اند از:
کروماتوگرافی گازی، کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC)، کروماتوگرافی لایه نازک (TLC) و کروماتوگرافی کاغذی.

 

دو فاز اصلی کروماتوگرافی

هر روش کروماتوگرافی بر دو فاز اساسی مبتنی است:
1- فاز ساکن (Stationary Phase): یک ماده جامد یا مایع تثبیت ‌شده که در داخل ستون یا روی سطح صفحه قرار دارد و ثابت است.
2- فاز متحرک (Mobile Phase): یک گاز یا مایع که نمونه را از روی فاز ساکن عبور می‌دهد.

این دو فاز به‌گونه ‌ای انتخاب می‌شوند که اجزا، بسته به قطبیت، اندازه، جرم مولکولی یا بار الکتریکی، با سرعت‌های متفاوت حرکت کنند و جداسازی اتفاق بیفتد.
سیکل جداسازی به‌طور خلاصه این‌گونه کار می‌کند: نمونه به فاز متحرک وارد می‌شود، سپس به ‌واسطه اختلاف در تمایل مولکولی (Affinity) به فاز ساکن، اجزا از هم تفکیک شده و در زمان‌های متفاوت از دستگاه خارج می‌شوند.

 

جهت دریافت خدمات و مشاوره رایگان با نیکوفامد تماس بگیرید.

 

انواع روش‌های کروماتوگرافی

کروماتوگرافی گونه‌های متعددی دارد که هر کدام برای نوع خاصی از داده یا نمونه مناسب است. این تکنیک‌ها را می‌توان از نظر فاز متحرک، نحوه جداسازی و شکل عملکرد طبقه‌بندی کرد:

کروماتوگرافی کاغذی (Paper Chromatography)

کروماتوگرافی کاغذی روشی ابتدایی است که با استفاده از کاغذ جاذب و حلال، اجزای یک مخلوط را بر اساس میزان حرکت روی کاغذ از هم جدا می‌کند.

نحوه عملکرد کروماتوگرافی کاغذی

در این روش، نمونه ابتدا روی کاغذ قرار داده می‌شود. سپس لبه کاغذ درون حلال (مانند آب) قرار می‌گیرد. حلال به‌سمت بالا حرکت کرده و به نمونه می‌رسد و باعث جداسازی اجزای آن می‌شود. این جداسازی امکان بررسی و تحلیل ترکیبات را فراهم می‌کند.

کاربردهای کروماتوگرافی کاغذی

این روش به‌طور گسترده در علوم جنایی برای شناسایی DNA از اثر انگشت استفاده می‌شود و همچنین در موارد زیر کاربرد دارد:
• رنگ‌های غذایی
• پایش واکنش‌ها
• رنگدانه‌های گیاهی
• مطالعات علمی برای شناسایی ترکیبات آلی و معدنی

 

کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC)

کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا یا High Performance Liquid Chromatography (HPLC) پرکاربردترین روش کروماتوگرافی در آزمایشگاه‌های کنترل کیفیتی است که با استفاده از حلال مایع پرفشار، ترکیبات محلول را در ستون جدا می‌کند و برای آنالیز دقیق کمی و کیفی به‌کار می‌رود. در HPLC، دقت بالا، تکرارپذیری مناسب و توانایی جداسازی ترکیبات پیچیده و غیر فرّار به سادگی امکان پذیر است.

 

نحوه عملکرد HPLC

در HPLC، فاز متحرک یک حلال یا مخلوطی از حلال‌ها است که تحت فشار بالا (معمولاً چند ده تا چند صد بار) از داخل ستونی پرشده با فاز ساکن عبور می‌کند. فاز ساکن معمولاً ذرات جامد بسیار ریز (مثلاً سیلیکا اصلاح‌شده) است که سطح فعال بالایی دارد. همین سطح فعال باعث می‌شود مولکول‌ها بسته به ویژگی‌های شیمیایی خود، زمان‌های متفاوتی را در ستون سپری کنند.
اصل جداسازی در HPLC معمولاً بر پایه قطبیت، برهم‌کنش‌های هیدروفوب، پیوند هیدروژنی یا برهم‌کنش یونی است. به‌عنوان مثال در HPLC فاز معکوس (Reverse Phase HPLC)، ترکیبات غیرقطبی زمان بیشتری در ستون باقی می‌مانند، در حالی که ترکیبات قطبی سریع‌تر شسته می‌شوند.

 

انواع آشکارسازها در کروماتوگرافی مایع

۱. آشکارساز UV / UV-Vis
رایج‌ترین آشکارساز در HPLC است که بر پایه جذب نور در طول موج مشخص عمل می‌کند. ترکیباتی که دارای گروه‌ های جذب‌کننده نور (کروموفور) هستند، در طول موج مناسب شناسایی و اندازه‌گیری می‌شوند. این آشکارساز برای بسیاری از داروها، ترکیبات آلی و مواد شیمیایی مناسب است.

 

۲. آشکارساز PDA
آشکارساز PDA نسخه پیشرفته‌تر UV است که به‌ جای ثبت جذب در یک طول موج، طیف جذب در محدوده‌ ای از طول موج‌ها را هم‌زمان ثبت می‌کند. این ویژگی علاوه بر اندازه‌گیری کمّی، امکان بررسی خلوص پیک و شناسایی تقریبی ساختار را نیز فراهم می‌کند.

 

۳. آشکارساز فلورسانس (Fluorescence Detector)
این آشکارساز برای ترکیباتی که به‌ طور طبیعی فلورسانس اند یا پس از مشتق‌سازی* (Derivatization) فلورسنت می‌شوند، حساسیت بسیار بالایی دارد. در غلظت‌های بسیار پایین، آشکارساز فلورسانس نسبت به UV عملکرد برتری دارد و در آنالیز برخی داروها، سموم و ترکیبات زیستی حساس به‌طور گسترده استفاده می‌شود.

 

۴. آشکارساز ضریب شکست (RI – Refractive Index Detector)
آشکارساز RI تغییرات ضریب شکست فاز متحرک را هنگام خروج نمونه از ستون اندازه‌گیری می‌کند. این روش برای ترکیباتی که جذب UV قابل‌توجهی ندارند (مانند بعضی قندها و پلیمرها) کاربرد دارد. با این حال، RI نسبت به تغییرات دما و ترکیب حلال حساس است و معمولاً در روش‌های ایزوکراتیک* به‌کار می‌رود.

 

۵. سامانه‌ های طبف سنجی جرمی LC–MS (Liquid Chromatography–Mass Spectrometry)
در LC–MS یا LC–MS/MS، پس از جداسازی توسط HPLC، ترکیبات وارد طیف‌سنج جرمی می‌شوند و بر اساس نسبت جرم به بار شناسایی و اندازه‌گیری می‌گردند. این تکنیک برای آنالیز ترکیبات پیچیده، متابولیت‌های دارویی و پروژه‌های تحقیقاتی پیشرفته، کاربرد دارد.

 

۶. آشکارساز پراکندگی نور تبخیری ELSD (Evaporative Light Scattering Detector)
در ELSD، فاز متحرک و نمونه به‌صورت مه (Nebulize) در می‌آیند، حلال تبخیر می‌شود و ذرات خشک باقی‌مانده، نور تابشی را پراکنده می‌کنند؛ شدت این پراکندگی مبنای سیگنال است. این آشکارساز برای ترکیباتی که جذب UV ندارند (برای مثل بسیاری از قندها، چربی‌ها و پلیمرها) مفید است و نسبت به RI حساسیت و پایداری بهتری ارائه می‌دهد.

برای آنالیز جواب ها، معمولاً از UV-Vis یا طیف‌سنجی جرمی (LC-MS / LC-MS/MS) استفاده میشود که امکان شناسایی و اندازه‌گیری بسیار دقیق را فراهم می‌کند.

 

کاربردهای HPLC

این روش برای جداسازی ترکیبات غیرفرّار مناسب است و در صنایع زیر ترجیح داده می‌شود:
• محیط زیست
• بیوتکنولوژی
• صنایع دارویی
• صنایع شیمیایی
• تحقیقات صنعتی
• تحقیقات نوشیدنی‌ها
به همین دلیل، HPLC از ارکان اصلی آزمون‌های فارماکوپه در صنایع دارویی، غذایی و آرایشی‌-‌بهداشتی محسوب می‌شود. البته این روش به‌شدت وابسته به اعتبارسنجی ، کیفیت ستون و مهارت اپراتور است و کوچک ‌ترین خطا می‌تواند نتیجه را مخدوش کند.

 

کروماتوگرافی گازی (GC)

کروماتوگرافی گازی یا Gas Chromatography (GC) روشی است که برای جداسازی و آنالیز ترکیبات فرّار یا قابل تبخیر طراحی شده است و در آن نمونه ی گازی همراه با گاز حامل از داخل ستون عبور می‌کند تا ترکیبات فرّار از هم جدا و اندازه‌گیری شوند. اگر ترکیب مورد نظر در دمای تعیین شده تبخیر نشود یا تجزیه شود، این روش عملاً غیرقابل استفاده خواهد بود.

 

نحوه عملکرد کروماتوگرافی گازی

در کروماتوگرافی گازی، یک سیلندر خارجی حاوی گاز بی‌اثر (معمولاً هلیوم یا گازهای غیرواکنش‌پذیر مشابه) وجود دارد که به آن گاز حامل گفته می‌شود. این گاز نمونه را درون دستگاه جابه‌جا می‌کند. نمونه پس از ورود به دستگاه، با گاز حامل ترکیب شده و به‌ سرعت به حالت گازی در می‌آید و وارد ستون میشود. داخل ستون، یک فاز ساکن پلی‌مری یا سیلیکونی قرار دارد که مواد با شدت‌ های مختلف به آن می‌چسبند. دمای ستون می‌تواند ثابت باشد یا به‌صورت برنامه‌ریزی‌شده (Temperature Programming) در طول آنالیز بالا برود تا جداسازی بهتر و سریع‌ تر صورت گیرد.

 

انواع آشکارسازها در کروماتوگرافی گازی

۱. آشکارساز شعله یونی (FID – Flame Ionization Detector)
در این روش، ترکیبات آلی پس از خروج از ستون در شعله سوزانده شده و یون تولید می‌کنند و جریان یونی ایجاد شده متناسب با مقدار ماده است. FID برای اندازه‌گیری طیف وسیعی از ترکیبات کربنی، روشی مطلوب محسوب می‌شود.

 

۲. آشکارساز رسانایی حرارتی (TCD – Thermal Conductivity Detector)
این آشکارساز اختلاف رسانایی حرارتی بین گاز حامل خالص و گاز حامل حاوی نمونه را اندازه‌گیری می‌کند. TCD یک آشکارساز نسبتاً عمومی است، اما حساسیت آن از FID پایین‌تر است. در آنالیز گازها و ترکیبات معدنی فرّار، TCD همچنان پرکاربرد محصوب میشود.

 

۳. آشکارساز جذب الکترون (ECD – Electron Capture Detector)
ECD برای ترکیباتی که تمایل بالایی به گرفتن الکترون دارند (مانند ترکیبات هالوژنه و بسیاری از آفت‌کش‌ های کلردار) استفاده میشود. این آشکارساز در آنالیز سموم کشاورزی، هالوژن ها و آلاینده‌های خاص زیستی اهمیت ویژه‌ ای دارد.

 

۴. آشکارسازهای فتومتریک شعله و نیتروژن فسفر (NPD / FPD)
همانطور که از نامشان پیداست آشکار ساز نیتروژن فسفر NPD (Nitrogen Phosphorus Detector) نسبت به ترکیبات حاوی نیتروژن و فسفر حساسیت انتخابی دارد، در حالی‌ که آشکار ساز فتومتریک شعله FPD (Flame Photometric Detector) برای ترکیبات حاوی گوگرد و فسفر مناسب است.

 

۵. طیف سنج جرمی GC–MS (Gas Chromatography–Mass Spectrometry)
در ترکیب GC با طیف‌سنجی جرمی (GC–MS)، پس از جداسازی کروماتوگرافی، ترکیبات وارد دستگاه طیف سنج جرمی شده و بر اساس نسبت جرم به بار (m/z) شناسایی می‌شوند. در این روش، علاوه بر جداسازی، امکان شناسایی ساختاری بسیار دقیق فراهم است.

 

۶. نورسنج شعله‌ای (FAES / Flame Atomic Emission)
در این نوع آشکارساز، ترکیبات پس از ورود به شعله، اتم‌هایشان برانگیخته شده و نور با طول موج مشخص ساطع می‌کنند؛ شدت این نور متناسب با غلظت عنصر مورد نظر است. FAES برای اندازه‌گیری عناصر خاص (مثل فلزات، گوگرد یا فسفر) کاربرد دارد و بیشتر در آنالیزهای عنصری استفاده می‌شود.

لازم به ذکر است که در آنالیزهای استاندارد، معمولا از FID (Flame Ionization Detector) یا TCD (Thermal Conductivity Detector) استفاده می‌شوند و در سطوح پیشرفته‌، ترکیب GC با طیف‌ سنجی جرمی (GC-MS) امکان شناسایی ساختاری بسیار دقیق را فراهم می‌کند. به‌همین دلیل، GC یکی از مهم‌ترین روش‌ها برای پایش حلال‌های باقی‌مانده، مواد فرّار و ترکیبات معطر  است.

 

مکانیزم جداسازی در GC عمدتاً بر اساس:
• نقطه جوش ترکیبات
• فشار بخار
• برهم‌کنش با فاز ساکن

انجام می‌شود. ترکیباتی که فرّارتر هستند یا برهم‌کنش ضعیف‌تری با فاز ساکن دارند، سریع‌تر از ستون خارج می‌شوند.

 

کاربردهای کروماتوگرافی گازی

این روش برای جداسازی مخلوط‌های فرّار ایده‌آل است و در صنایع زیر کاربرد گسترده دارد:
• صنایع دارویی
• پزشکی
• کشاورزی
• محیط زیست
• علوم جنایی
• صنایع مختلف
• صنایع غذایی و نوشیدنی
• محصولات آرایشی، بهداشتی و شوینده
نکته مهم این است که گرچهGC بسیار حساس و دقیق است، اما دامنه کاربرد آن محدودتر از HPLC است و نمی‌توان آن را جایگزین روش های دی دانست.

 

کروماتوگرافی لایه نازک (TLC)

کروماتوگرافی لایه نازک یا Thin Layer Chromatography (TLC) ساده‌ترین و در عین حال قدیمی‌ترین شکل رایج کروماتوگرافی است که در آن نمونه روی صفحه پوشیده از سیلیکا/آلومینا قرار می‌گیرد و با حرکت حلال، لکه‌های جداگانه برای شناسایی و مقایسه ایجاد می‌شود

 

نحوه عملکرد کروماتوگرافی لایه نازک

در TLC، فاز ساکن یک لایه نازک از ماده جاذب (معمولاً سیلیکا ژل یا آلومینا) است که روی یک صفحه شیشه‌ای یا آلومینیومی پوشانده شده. فاز متحرک یک حلال یا مخلوطی از چند حلال‌ است که از پایین صفحه به‌ صورت موئینگی بالا می‌رود و نمونه را با خود حمل می‌کند.
ترکیبات نمونه بسته به میزان تمایل‌شان به فاز ساکن یا فاز متحرک، با سرعت‌های متفاوت حرکت می‌کنند و در ارتفاع‌های مختلف متوقف می‌شوند. نتیجه به‌صورت لکه‌هایی مجزا قابل مشاهده است که با پارامتری به نام ضریب بازداری یا Rf (Retention Factor) توصیف می‌شوند.

برای ترکیباتی که با چشم دیده نمی‌شوند، از معرف های رنگ آمیزی (Staining Reagents) استفاده می‌شود تا لکه‌ها بعد از خشک شدن صفحه، رنگی و قابل مشاهده شوند. به این ترتیب، TLC یک ابزار غربالگری سریع و کم‌هزینه محسوب می‌شود.

 

کاربردهای TLC

این تکنیک بیشتر برای آزمایش‌های کوچک و بررسی‌های اولیه به‌کار می‌رود، از جمله:
• شیمی مواد غذایی
• کشاورزی (به‌ویژه آنالیز سموم)
• سم‌شناسی
• صنایع دارویی
به‌کار می‌رود. این روش سریع، کم‌هزینه و ساده است، اما دقت و حساسیت آن به‌هیچ‌وجه قابل مقایسه با HPLC یا GC نیست.

 

مقایسه انواع روش‌های کروماتوگرافی

فاز متحرک	ویژگی برجسته	کاربرد کلیدی	روش کروماتوگرافی
مایع	دقت بالا، مناسب نمونه‌های غیر فرّار	کنترل کیفیت دارویی، غذایی	HPLC
گاز	سریع، مناسب ترکیبات فرّار	آنالیز حلال‌ها، ترکیبات قابل تبخیر ‌	GC
لایه نازک	ارزان، سریع، ساده	بررسی کیفی اولیه	TLC

 

جهت دریافت خدمات و مشاوره رایگان با نیکوفامد تماس بگیرید.

 

سوالات پرتکرار

 

۱- کروماتوگرافی چیست و چه اهمیتی دارد ؟

کروماتوگرافی روش جداسازی مولکول‌ها بر اساس تعامل با دو فاز متفاوت است که امکان شناسایی، اندازه‌گیری و خالص‌سازی ترکیبات را فراهم می‌کند و در کنترل کیفیت صنعتی و تحقیقاتی کاربرد گسترده دارد.

۲- تفاوت کروماتوگرافی مایع و گازی چیست؟

در HPLC فاز متحرک مایع است و برای ترکیبات غیر فرّار مناسب است، در حالی که GC از فاز متحرک گازی استفاده می‌کند و برای ترکیبات فرّار به‌کار می‌رود.

۳- چه نوع نمونه‌ ای برای کروماتوگرافی مناسب است؟

نمونه‌های فرّار برای GC، نمونه‌های محلول و غیرفرّار برای HPLC، و محلول‌ های ساده برای TLC و کروماتوگرافی کاغذی مناسب‌ اند.

۴- نقش تمایل مولکولی (Affinity) در جداسازی چیست؟

دلیل اصلی جداسازی در کروماتوگرافی، تفاوت در تمایل مولکولی اجزای نمونه به فاز ساکن و فاز متحرک است. برخی مولکول‌ها به‌دلیل ساختار شیمیایی، قطبیت یا اندازه خود، برهم‌کنش قوی‌تری با فاز ساکن برقرار می‌کنند و مدت بیشتری در آن باقی می‌مانند، در حالی که سایر مولکول‌ها ترجیح می‌دهند همراه فاز متحرک حرکت کنند. همین اختلاف در تمایل، باعث ایجاد اختلاف سرعت و در نهایت تفکیک اجزا می‌شود.

۵- مقدار ضریب بازداری یا Rf (Retention Factor) چیست؟

Rf یا ضریب بازداری (Retention Factor) در کروماتوگرافی کاغذی و TLC عددی است که نشان می‌دهد یک لکه چه‌قدر روی صفحه حرکت کرده است؛
به‌صورت ساده:

Rf = (مسافت طی‌شده لکه) / (مسافت طی‌شده جبهه حلال)

​یعنی هرچه Rf بزرگ‌تر باشد، آن ترکیب بیشتر همراه حلال حرکت کرده و تمایلش به فاز متحرک بیشتر بوده است.

 

*مشتق‌سازی (Derivatization) یعنی آنالیت‌/مادهٔ مورد اندازه‌گیری را به‌صورت شیمیایی تغییر دهیم تا راحت تر تبخیر شود و توسط شناساگر بهتر تحلیل شود.

*اگر فاز متحرک استفاده شده در تست HPLC در طول فرایند کروماتوگرافی ثابت و بدون تغییر باشد به این روش، کروماتوگرافی ایزوکراتیک Isocratic گفته میشود.