تست MTT یک روش رنگ‌سنجی (colorimetric assay) برای ارزیابی حیات سلولی (cell viability)، تکثیر سلولی (cell proliferation) و سمیت سلولی (cytotoxicity) است. این تست بر اساس فعالیت میتوکندریایی سلول‌ها انجام می‌شود و میزان فعالیت متابولیک سلول‌های زنده را اندازه‌گیری می‌کند.
جهت کسب اطلاعات بیشتر در رابطه با آزمون سمیت سلولی کلیک کنید.
مکانیسم تست MTT چگونه است؟
ورود MTT به سلول و احیای آن در میتوکندری
ماده اولیه این تست، یک ترکیب تترازولیومی زردرنگ و محلول در PBS است که به نور حساس بوده و به دلیل بار مثبت خالص خود، جذب غشای سلول شده و از طریق اندوسیتوز وارد سلول می‌شود. این ترکیب پس از ورود، مستقیماً به میتوکندری رفته و توسط آنزیم سوکسینات دهیدروژناز که بخشی از زنجیره تنفسی میتوکندری است، احیا می‌شود.
تبدیل تترازولیوم به فورمازان
در این مرحله، احیای MTT منجر به تولید رسوبات بنفش‌رنگ فورمازان می‌شود. این واکنش به‌طور اختصاصی در سلول‌های زنده رخ می‌دهد، چرا که تنها سلول‌هایی که زنجیره تنفسی فعال دارند، قادر به احیای MTT هستند. سلول‌های مرده یا دچار نکروز، این قابلیت را ندارند و بنابراین رنگی در آن‌ها ایجاد نمی‌شود.
اندازه‌گیری شدت رنگ برای ارزیابی زنده‌مانی سلولی
شدت رنگ بنفش ایجاد شده متناسب با تعداد سلول‌های زنده است و برای اندازه‌گیری آن از دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 570 نانومتر (با طول موج مرجع 630 نانومتر) استفاده می‌شود. افزایش جذب نوری (OD) نشان‌دهنده حیات بیشتر سلولی و کاهش آن بیانگر اثر سمی دارو یا شرایط آزمایش بر سلول‌ها است.
مراحل اجرای تست MTT
کشت سلولی (Seeding)
تعداد مناسبی از سلول‌ها در پلیت 96 چاهکی کشت داده شده و به مدت 24 ساعت در انکوباتور قرار داده می‌شوند تا به کف چاهک‌ها متصل شوند.
تیمار سلولی (Treatment)
پس از اتصال سلول‌ها، چاهک‌های آزمایش انتخاب شده و داروی موردنظر یا سایر تیمارهای شیمیایی به آن‌ها اضافه می‌شود.
چاهک‌های کنترل شامل کنترل مثبت (C+) و کنترل منفی (Blank) نیز در نظر گرفته می‌شوند.
سلول‌ها بسته به طراحی آزمایش، برای 24، 48 یا 72 ساعت در انکوباتور نگهداری می‌شوند.
افزودن MTT و تجزیه فورمازان
محیط کشت حاوی دارو تخلیه شده و به هر چاهک 200 میکرولیتر از محلول MTT (با غلظت 0.5 میلی‌گرم در میلی‌لیتر) اضافه می‌شود.
پلیت به مدت 2 تا 4 ساعت در انکوباتور 37 درجه سلسیوس قرار داده می‌شود تا سلول‌های زنده MTT را احیا کنند.
در این مدت، کریستال‌های فورمازان بنفش در سلول‌های زنده تشکیل شده که در زیر میکروسکوپ نیز قابل مشاهده هستند.
حل کردن فورمازان و خوانش نتایج
از آنجایی که فورمازان در آب نامحلول است، برای حل کردن آن از دی‌متیل سولفوکساید (DMSO) یا ایزوپروپانول استفاده می‌شود.
پس از حل شدن، شدت رنگ با دستگاه میکروپلیت ریدر اندازه‌گیری شده و مقدار OD برای هر نمونه ثبت می‌شود.
تفسیر تست MTT
سطح بالای جذب نوری: این نشان‌دهنده تعداد زیاد سلول‌های زنده است که به طور فعال متابولیسم دارند و در نتیجه رنگ MTT را به فرم متزازول تبدیل کرده‌اند.
سطح پایین جذب نوری: این نشان‌دهنده کاهش تعداد سلول‌های زنده است که می‌تواند ناشی از سمیت یا آسیب سلولی باشد.
اگر ماده یا دارویی که تست می‌شود اثر سمی بر سلول‌ها داشته باشد، میزان جذب MTT کاهش می‌یابد.
معمولاً مقدار جذب نوری (OD) در گروه‌های مختلف مقایسه می‌شود و درصد زنده‌ماندن سلول‌ها در گروه‌های مختلف به صورت درصدی از گروه کنترل محاسبه می‌شود:
% زنده‌ماندن=(ODکنترل/ODنمونه)×100
جهت دریافت خدمات و مشاوره رایگان با نیکوفامد تماس بگیرید.
تجهیزات موردنیاز برای انجام تست MTT
برای اجرای تست MTT، به مجموعه‌ای از تجهیزات تخصصی نیاز است که هرکدام نقش کلیدی در کشت سلولی، انکوباسیون، رنگ‌سنجی و آنالیز داده‌ها ایفا می‌کنند. این تجهیزات به‌طور کلی شامل ابزارهای کشت سلول، دستگاه‌های آنالیز رنگ، و تجهیزات استریل‌سازی هستند.
دستگاه‌های موردنیاز برای کشت و تیمار سلولی
هود ایمنی زیستی کلاس II
مجهز به فیلتر هپا (HEPA) و جریان هوای لامینار جهت جلوگیری از آلودگی نمونه‌ها
دارای لامپ UV برای استریل‌سازی فضای داخلی
استفاده برای کشت سلول و آماده‌سازی محلول‌ها در محیط استریل
انکوباتور CO₂
شرایط ایده‌آل رشد سلولی با دمای 37 درجه سانتی‌گراد، 5% CO₂ و 95% رطوبت
کنترل pH محیط کشت از طریق تنظیم سطح گاز CO₂
بن ماری (Water Bath)
جهت گرم کردن محیط کشت و محلول‌ها تا دمای مطلوب (معمولاً 37 درجه سانتی‌گراد)
استفاده برای ذوب کردن نمونه‌های فریز شده بدون آسیب به سلول‌ها
سانتریفیوژ
برای جداسازی سلول‌ها از محیط کشت یا ته‌نشین کردن اجزای سلولی قبل از رنگ‌سنجی
تنظیمات سرعت و زمان بسته به نوع نمونه
میکروسکوپ اینورت (Inverted Microscope)
مشاهده چسبندگی و مورفولوژی سلول‌ها در چاهک‌ها
بررسی تشکیل کریستال‌های فورمازان پس از تیمار با MTT
تجهیزات موردنیاز برای انجام آنالیز MTT
پلیت 96 چاهکی (Microplate 96-well)
استفاده برای کشت سلولی و انجام تست در چندین تکرار همزمان (High-throughput)
سطح مناسب برای اتصال سلول‌ها و رنگ‌سنجی دقیق
دستگاه اسپکتروفتومتر یا الایزا ریدر (Microplate Reader)
اندازه‌گیری جذب نوری (OD) در طول موج 570 نانومتر برای تحلیل داده‌های MTT
قابلیت خوانش چندین نمونه همزمان برای تسریع فرآیند آنالیز
بعضی مدل‌ها دارای طول موج مرجع (630 نانومتر) برای دقت بالاتر هستند
اتوکلاو (Autoclave)
استریل‌سازی محیط کشت، پلیت‌ها و ابزارهای شیشه‌ای برای جلوگیری از آلودگی
استفاده از بخار با دمای بالا و فشار زیاد برای اطمینان از نابودی میکروارگانیسم‌ها
مواد شیمیایی و محلول‌های موردنیاز
MTT حل‌شده در PBS → برای رنگ‌سنجی سلول‌های زنده
DMSO یا ایزوپروپانول → برای حل کردن کریستال‌های فورمازان قبل از خوانش رنگ
محیط کشت DMEM یا RPMI → برای تأمین مواد مغذی رشد سلولی
سرم جنین گاوی (FBS) → منبع پروتئینی موردنیاز سلول‌ها
آزمایشگاه همکار نیکوفارمد با بهره‌گیری از تکنیک‌های پیشرفته و تجهیزات مدرن، آزمون سمیت سلولی MTT را برای ارزیابی اثرات دارویی و ترکیبات شیمیایی بر روی سلول‌های زنده انجام می‌دهد.