آزمون اندوتوکسین چیست؟

آزمون اندوتوکسین LAL (Limulus Amebocyte Lysate) برای تشخیص اندوتوکسین‌های باکتری‌های گرم منفی انجام می شود که از لیزات سلول‌های خرچنگ نعل‌اسبی تهیه می‌شود. این آزمون با استفاده از واکنش ژل‌سازی، وجود اندوتوکسین را با دقت بالا شناسایی می‌کند و به‌طور گسترده در صنایع دارویی برای اطمینان از ایمنی محصولات استفاده می‌شود.

آزمون اندوتوکسین، یکی از روش‌های مهم تشخیص و اندازه‌گیری اندوتوکسین‌ها است، که بخش‌هایی از دیواره سلولی باکتری‌های گرم منفی را شامل می‌شوند. این مواد می‌توانند واکنش‌های التهابی شدیدی را در انسان‌ها و حیوانات ایجاد کنند. بنابراین، تشخیص آن‌ها در محصولات دارویی، به ویژه آن دسته از داروهایی که مستقیماً به بدن تزریق می‌شوند، بسیار حیاتی است. آزمون اندوتوکسین به منظور اطمینان از عدم وجود این ترکیبات سمی در داروها و محصولات درمانی انجام می‌گیرد و اغلب از طریق تست LAL که با استفاده از خون خرچنگ لیمولوس انجام می‌شود، صورت می‌گیرد.

جهت دریافت خدمات و مشاوره رایگان با نیکوفامد تماس بگیرید.

انواع روش های آزمون اندوتوکسین

تست LAL (Limulus Amebocyte Lysate) به عنوان یکی از روش‌های استاندارد برای سنجش اندوتوکسین‌ها در محصولات دارویی و بیولوژیکی شناخته شده است. این تست از سه روش مختلف برای تشخیص و اندازه‌گیری اندوتوکسین‌ها استفاده می‌کند که به شرح زیر است:

1.روش ژل کلات (Gel-clot method)

این روش مبتنی بر توانایی اندوتوکسین برای فعال کردن عامل پروتئینی در LAL است که منجر به تشکیل ژل می‌شود. نمونه به لیزات امبوسیت لیمولوس اضافه می‌شود و در صورت وجود اندوتوکسین، محلول به ژل تبدیل می‌شود. این واکنش نشان‌دهنده حضور اندوتوکسین در نمونه است. روش ژل کلات به دلیل سادگی و هزینه کم، بسیار محبوب است اما حساسیت آن کمتر از دیگر روش‌های LAL است.

2. روش کروموژنیک (Chromogenic method)

روش کروموژنیک بر پایه تغییر رنگ ناشی از واکنش بین اندوتوکسین و یک سوبسترا کروموژنیک خاص است. در این روش، اندوتوکسین‌ها باعث فعال‌سازی یک زنجیره انزیمی در LAL می‌شوند که نهایتاً به تولید رنگ منجر می‌شود. این رنگ می‌تواند به طور کمی با استفاده از اسپکتروفتومتر اندازه‌گیری شود. روش کروموژنیک برای تعیین مقادیر کم اندوتوکسین مناسب است و دقت بالایی دارد.

3. روش کدورت سنجی (Turbidimetric method)

در روش کدورت‌سنجی، میزان کدورت نمونه‌ای که به آن LAL اضافه شده، اندازه‌گیری می‌شود. این کدورت ناشی از تشکیل پیچیده‌های ناپایدار بین اندوتوکسین و عوامل درون LAL است. میزان کدورت با استفاده از نفوذ نور و اندازه‌گیری میزان نوری که از نمونه عبور می‌کند، سنجیده می‌شود. این روش برای سنجش سریع و دقیق اندوتوکسین در محدوده‌های گسترده‌ای از غلظت‌ها مناسب است.
هر یک از این روش‌ها بسته به نوع نمونه و دقت مورد نیاز در تشخیص اندوتوکسین می‌تواند استفاده شود. انتخاب روش مناسب بر اساس نیاز خاص تست و شرایط آزمایشگاهی تعیین می‌گردد.

جهت آشنایی با آزمون های میکروبی کلیک کنید.

استاندارد تست اندوتوکسین

آزمایشگاه همکار نیکوفارمد با بهره‌گیری از تجهیزات پیشرفته و نیروی متخصص، آزمون اندوتوکسین را به‌صورت تخصصی و مطابق با آخرین الزامات بین‌المللی و ملی انجام می‌دهد. این آزمایشگاه، آزمون اندوتوکسین فرآورده‌های دارویی را براساس استاندارد معتبر USP 85 (آزمایش اندوتوکسین با روش LAL) انجام می‌دهد که یکی از مهم‌ترین مراجع علمی در صنعت داروسازی برای ارزیابی ایمنی تزریقات و فرآورده‌های استریل به‌شمار می‌رود.

همچنین، در حوزه تجهیزات پزشکی، آزمون اندوتوکسین توسط نیکوفارمد مطابق با استاندارد ملی ایران INSO 10572 انجام می‌شود؛ این استاندارد با بهره‌گیری از اصول روش USP 85 و انطباق با الزامات تجهیزات پزشکی، چارچوب دقیق و اطمینان‌بخشی برای کنترل اندوتوکسین در وسایل و محصولات پزشکی فراهم می‌کند.

مراحل انجام تست اندوتوکسین

•  آماده‌سازی نمونه

ابتدا، نمونه‌ها باید تحت شرایط استریل آماده شوند تا از آلودگی میکروبی و ایجاد نتایج نادرست جلوگیری شود. نمونه‌ها معمولاً رقیق می‌شوند تا در محدوده استاندارد حساسیت تست قرار گیرند.

•  استانداردسازی اندوتوکسین

یک استاندارد اندوتوکسین (معمولاً از باکتری E. coli تهیه شده) برای تعیین منحنی استاندارد و محاسبه غلظت اندوتوکسین در نمونه‌ها آماده می‌شود. این کار به تعیین دقیق‌تر میزان اندوتوکسین در نمونه‌ها کمک می‌کند.

•  آماده‌سازی LAL

لیزات امبوسیت لیمولوس (LAL) که حاوی عوامل حساس به اندوتوکسین است، آماده می‌شود. این ماده باید در شرایط کنترل شده نگهداری و استفاده شود تا فعالیت آنزیمی آن حفظ شود.

•  انجام واکنش

نمونه‌ها، استانداردها، و کنترل‌ها در حضور LAL با یکدیگر مخلوط می‌شوند و در دمای مناسب (معمولاً ۳۷ درجه سلسیوس) برای مدت زمان مشخصی (حدود ۱ ساعت) نگهداری می‌شوند. در این مدت، اندوتوکسین موجود در نمونه باعث فعال‌سازی کاسکاد آنزیمی در LAL می‌شود که منجر به تغییرات قابل مشاهده (مثل تشکیل ژل، تغییر رنگ یا تغییرات کدورت) می‌گردد.

•  تفسیر نتایج

پس از اتمام واکنش، نتایج بر اساس نوع تست LAL مورد استفاده تفسیر می‌شوند:
ژل کلات: وجود یک ژل سفت در کف لوله نشان‌دهنده مثبت بودن نمونه برای اندوتوکسین است.
کروموژنیک: تغییر رنگ محلول نشان‌دهنده حضور اندوتوکسین است و با اسپکتروفتومتر قابل اندازه‌گیری است.
کدورت سنجی: افزایش کدورت محلول به دلیل فعالیت اندوتوکسین قابل اندازه‌گیری با توربیدومتر است.
این نتایج به تعیین میزان اندوتوکسین در نمونه‌ها و ارزیابی ایمنی محصولات دارویی و بیولوژیکی کمک می‌کند.

مکانیزم بیوشیمیایی تست LAL

خون خرچنگ نعل اسبی حاوی امبوسیت‌هایی است که در صورت تماس با اندوتوکسین‌ها، یک زنجیره واکنشی پروتئازی فعال می‌شود. این زنجیره واکنشی به شرح زیر است:

• فعال‌سازی فاکتور C: اندوتوکسین‌ها به صورت اتوکاتالیتیک فاکتور C را فعال می‌کنند که یک سرین پروتئاز است. این فاکتور فعال شده، به نوبه خود، فاکتور B را فعال می‌کند.

• فعال‌سازی فاکتور B: فاکتور B که اکنون فعال شده، پروتئین مرتبط با تشکیل لخته (فاکتور G) را فعال می‌کند.

• تشکیل لخته: فعال شدن فاکتور G به تشکیل یک پلیمر محکم منجر می‌شود که با ساختاری شبیه به فیبرینوژن در بدن انسان، یک لخته نامحلول تشکیل می‌دهد.

این روش به شدت به β-D-glucan حساس است، که می‌تواند به طور نادرست فاکتور G را فعال کند و نتایج تست را مختل کند. به همین دلیل، در تست‌های LAL از مهارکننده‌های β-D-glucan استفاده می‌شود تا از این تداخل جلوگیری شود.

تفاوت‌های تست اندوتوکسین و تست تب‌زایی درون‌تنی در خرگوش

معیار	تست تب‌زایی درون‌تنی خرگوش (Rabbit Pyrogen Test)	تست تب‌زایی برون‌تنی LAL (Limulus Amebocyte Lysate)
نوع تست	بیولوژیک درون‌تنی (In Vivo)	بیوشیمیایی برون‌تنی (In Vitro)
نمونه آزمایشی	خرگوش زنده	لیزات سلول‌های آمیبوسیت خرچنگ نعل اسبی (Limulus)
نوع پیروژن قابل شناسایی	همه انواع پیروژن‌ها (اندوتوکسین، اگزوتوکسین، باقی‌مانده‌های سلولی و…)	فقط اندوتوکسین‌های باکتری‌های گرم منفی
حساسیت	کمتر از LAL (وابسته به دوز و پاسخ بیولوژیک حیوان)	بسیار بالا (حتی مقادیر پیکوگرم اندوتوکسین را شناسایی می‌کند)
معیار ارزیابی	افزایش دمای بدن خرگوش (بیش از 0.5 درجه سانتی‌گراد)	ایجاد ژل یا کدورت در لیزات بر اثر وجود اندوتوکسین
مدت زمان انجام	معمولاً ۳ تا ۵ ساعت (گاهی بیشتر با دوره‌های پیش‌آزمایی)	حدود ۳۰ تا ۶۰ دقیقه
هزینه و منابع	پرهزینه، نیازمند مراقبت حیوانات زنده، محیط کنترل‌شده	کم‌هزینه‌تر، بدون نیاز به حیوان زنده
محدودیت‌های قانونی و اخلاقی	محدودیت‌های اخلاقی به دلیل استفاده از حیوانات	فاقد محدودیت‌های اخلاقی حیوانی
کاربرد رایج	محصولات پیچیده یا مشکوک به پیروژن‌های غیراندوتوکسینی	محصولات تزریقی، داروها و تجهیزات پزشکی فاقد پیروژن‌های غیراندوتوکسینی

نکات مهم

یکی از اصلی‌ترین تفاوت‌ها این است که تست تب‌زایی خرگوش توانایی شناسایی تمامی انواع پیروژن‌ها را دارد، اما تست LAL تنها مختص اندوتوکسین‌های گرم منفی است. بنابراین برای محصولاتی که احتمال وجود پیروژن‌های غیراندوتوکسینی (مانند اگزوتوکسین‌های باکتری‌های گرم مثبت یا باقی‌مانده‌های قارچی) در آن‌ها هست، تست خرگوش همچنان انتخاب الزامی است.

با پیشرفت روش‌های برون‌تنی و قوانین حمایت از حیوانات، تست LAL تا حد زیادی جایگزین تست تب‌زایی خرگوش شده است؛ اما در محصولاتی با ترکیبات پیچیده یا مشکوک به حضور انواع مختلف پیروژن‌ها، آزمون خرگوش هنوز مرجع نهایی است.

برای داروها و تجهیزات تزریقی ساده تست LAL کافی است.

برای فرآورده‌های بیولوژیک پیچیده یا محصولاتی با ترکیبات ناشناخته انجام تست تب‌زایی خرگوش توصیه می‌شود یا ترکیب هر دو تست جهت پوشش کامل خطرات.

جهت آشنایی با آزمون استریلیتی کلیک کنید.

فرایند های جلوگیری از ایجاد الودگی اندوتوکسین

جلوگیری از آلودگی اندوتوکسین در محصولات بیولوژیکی و دارویی نیازمند یک سری فرایندهای دقیق و منظم است که شامل کنترل‌های محیطی، استریلیزاسیون، فرایندهای تولید، و آزمایش‌های مکرر می‌شود. در ادامه، به بررسی فرایندهای کلیدی برای جلوگیری از این نوع آلودگی پرداخته‌ایم.

 کنترل‌های محیطی

حفظ محیط تولید به صورت استریل و تمیز از اهمیت بالایی برخوردار است. استفاده از مواد ضدعفونی‌کننده مؤثر و اطمینان از تمیزکاری دوره‌ای محیط می‌تواند در کاهش خطر آلودگی ناخواسته کمک کند.
محدود کردن دسترسی به مناطق تولید تنها به افراد آموزش دیده و مجاز و استفاده از لباس‌های مناسب برای جلوگیری از ورود آلاینده‌ها از محیط خارج.

 استریلیزاسیون مواد و تجهیزات

استریلیزاسیون با استفاده از حرارت مرطوب یا خشک برای حذف هرگونه آلاینده بیولوژیکی که ممکن است حاوی اندوتوکسین باشد.
استفاده از فیلترهای با قابلیت جذب بالا برای حذف ذرات و میکروب‌ها از مواد اولیه قبل از ورود به فرایند تولید.

 کنترل فرایندهای تولید

تولید در شرایط کاملاً استریل برای جلوگیری از هرگونه آلودگی میکروبی و غیرمیکروبی، به خصوص در مراحل حساس فرایند.
نظارت و کنترل دقیق بر شرایط فرایند، مانند pH و دما، که می‌تواند بر رشد باکتری‌های گرم منفی تأثیر بگذارد و از تشکیل اندوتوکسین‌ها جلوگیری کند.

 آزمایش و بازرسی محصولات

انجام تست‌های منظم LAL برای اطمینان از عدم وجود اندوتوکسین در محصولات نهایی. این تست‌ها باید به صورت دوره‌ای و بر اساس دستورالعمل‌های استاندارد انجام شوند.
بررسی نمونه‌هایی از محصولات در مراحل مختلف تولید برای اطمینان از عدم وجود آلودگی و رعایت استانداردهای کیفی.

 آموزش و پرورش کارکنان

برگزاری دوره‌های آموزشی برای کارکنان در مورد اهمیت رعایت اصول آسپتیک، شناسایی خطرات اندوتوکسین و روش‌های پیشگیری از آلودگی.
این فرایندها، زمانی که به درستی و با دقت اجرا شوند، می‌توانند به طور مؤثری خطر آلودگی اندوتوکسین را در محصولات بیولوژیکی کاهش دهند و ایمنی و کیفیت بالای محصولات را تضمین کنند.

آزمایشگاه همکار نیکوفارمد، با بهره‌گیری از کادری مجرب و تجهیزات پیشرفته، خدمات تخصصی در زمینه انجام تست اندوتوکسین را ارائه می‌دهد. این تست، که به منظور تعیین میزان اندوتوکسین‌ها در محصولات پزشکی و دارویی صورت می‌پذیرد، نقش کلیدی در تضمین ایمنی و سلامت محصولات ارائه شده دارد. تعهد آزمایشگاه به استفاده از فناوری‌های به روز و نیروی انسانی کارآمد، اطمینان از رعایت دقیق‌ترین استانداردهای بین‌المللی را ممکن ساخته و به پیشبرد اهداف کیفی شرکت نیکوفارمد در راستای ارتقاء سطح سلامت جامعه کمک شایانی می‌نماید.