آزمون تب زایی درون تنی چیست؟

آزمون تب زایی درون تنی برای شناسایی پیروژن‌ها در فرآورده‌های تزریقی و داروهای استریل است که با تزریق نمونه به ورید گوش خرگوش و پایش دمای مقعدی در زمان‌بندی مشخص انجام می‌شود. در این روش، پس از ثبت دمای پایه، افزایش دما در  خرگوش های سالم طی پس از بازه زمانی بعد از تزریق اندازه‌گیری و با حدود مجاز USP مقایسه می‌شود؛ اگر مجموع افزایش دما بیش از مقادیر تعیین‌شده باشد، محصول غیرقابل قبول است.

آزمون تب زایی درون تنی به دلیل حساسیت بالای خرگوش به لیپوپلی‌ساکاریدهای باکتریایی و دیگر تب‌زاها، آزمونی قابل‌اعتمادی برای تضمین ایمنی و پیشگیری از واکنش‌های تب‌زا در بیماران پیش از عرضه فرآورده به بازار محسوب می‌شود.

 

جهت دریافت خدمات و مشاوره رایگان با نیکوفامد تماس بگیرید.

 

آزمون تب زایی درون تنی چگونه انجام می شود؟

انتخاب حیوانات

۳ خرگوش سالم، بالغ، با وزن ۱٫۵ تا ۳ کیلوگرم

بدون سابقه بیماری یا واکنش غیرعادی در تست‌های قبلی

استراحت حداقل ۱۶ ساعت قبل از آزمون

اندازه‌گیری دمای پایه

ثبت دمای مقعدی هر خرگوش در ۳۰ دقیقه قبل از تزریق، در سه نوبت ۱۰ دقیقه‌ای

نوسان دمای پایه نباید بیش از ۰٫۲ درجه سانتی‌گراد باشد

تزریق نمونه

تزریق فرآورده تست به ورید گوش طی حداکثر ۴ دقیقه

حجم و دوز مطابق فرمول USP، بدون ایجاد استرس به حیوان

پایش دما

اندازه‌گیری دمای مقعدی در فواصل ۳۰ دقیقه‌ای تا ۳ ساعت بعد از تزریق

محاسبه افزایش دما

افزایش دمای هر حیوان نسبت به بالاترین دمای پایه‌اش محاسبه می‌شود.

مجموع افزایش دما در سه خرگوش نباید بیش از 1.15°C باشد و افزایش دما در هیچ خرگوشی بیش از 0.6°C نباشد (در صورت فراتر رفتن، آزمون تکرار یا رد می‌شود)

تفسیر نتیجه

اگر شرایط قبولی برآورده شود → فرآورده فاقد تب‌زای قابل‌تشخیص است.

اگر مردود شود → محصول غیرقابل عرضه و نیازمند بررسی علت آلودگی پیروژنی است.

 

برای آشنایی با انواع آزمون های زیست سازگاری کلیک کنید.

 

مرحله	توضیحات تخصصی	معیار پذیرش / نکته کلیدی
1. انتخاب حیوانات	۳ خرگوش سالم، بالغ، ۱٫۵–۳ کیلوگرم، بدون سابقه واکنش غیرعادی، استراحت ≥ ۱۶ ساعت	سلامت و شرایط وزنی الزامی
2. دمای پایه	ثبت دمای مقعدی در سه نوبت ۱۰ دقیقه‌ای قبل از تزریق	نوسان ≤ ۰٫۲°C
3. تزریق نمونه	تزریق وریدی گوش طی ≤ ۴ دقیقه، حجم و دوز طبق فرمول USP	بدون ایجاد استرس
4. پایش دما	اندازه‌گیری هر ۳۰ دقیقه تا ۳ ساعت پس از تزریق	پایش دقیق و پیوسته
5. محاسبه افزایش دما	مقایسه با بالاترین دمای پایه هر خرگوش	افزایش هر خرگوش ≤ ۰٫۶°C و مجموع سه خرگوش ≤ ۱٫۱۵°C
6. تفسیر نتایج	انطباق با حدود پذیرش = قبولی	فراتر رفتن از حد = مردود / تکرار
7. ملاحظات	استفاده فقط وقتی BET قابل انجام نباشد، محیط آرام و کنترل دما	تضمین صحت نتایج

برای آشنایی با آزمون سمیت سلولی کلیک کنید.

 

مکانیسم ایجاد تب در تست تب‌ زایی درون تنی چگونه است؟

در تست تب‌ زایی درون‌ تنی، مکانیسم ایجاد تب بر پایه پاسخ ایمنی ذاتی به پیروژن‌ها (به‌ویژه اندوتوکسین‌های باکتری‌های گرم‌منفی مانند لیپوپلی‌ساکاریدها) عمل می‌کند. این مولکول‌ها پس از ورود به بدن خرگوش، توسط گیرنده‌های الگوی شناسایی (PRRs) نظیر TLR4 روی ماکروفاژها و مونوسیت‌ها شناسایی شده و موجب فعال‌سازی مسیرهای پیام‌رسانی داخل‌سلولی (مثل NF-κB) می‌شوند.

نتیجه این فعال‌سازی، ترشح سیتوکین‌های تب‌زا از جمله IL-1β، TNF-α و IL-6 است که به جریان خون وارد شده و به هیپوتالاموس می‌رسند. در هیپوتالاموس، این سیتوکین‌ها سنتز پروستاگلاندین E2 (PGE2) را تحریک می‌کنند. PGE2 با اثر بر نورون‌های تنظیم دما، نقطه تنظیم (set point) حرارتی بدن را بالا برده و منجر به افزایش دمای بدن می‌شود.

اهمیت تست تب زایی درون تنی در کنترل کیفیت فرآورده‌های تزریقی به این دلیل است که حتی مقادیر بسیار کم پیروژن‌ها می‌توانند در انسان باعث تب، لرز، افت فشار خون و در موارد شدید، شوک سپتیک شوند. از آنجا که برخی پیروژن‌ها با استریلیزاسیون از بین نمی‌روند، آزمون تب‌زایی درون‌تنی به‌عنوان یک روش بیولوژیک حساس، آخرین خط دفاعی برای اطمینان از ایمنی محصول قبل از مصرف انسانی محسوب می‌شود، به‌ویژه زمانی که آزمون BET (اندوتوکسین باکتریایی) قابل انجام نباشد یا خطر وجود تب‌زاهای غیراندوتوکسینی مطرح باشد.

برای آشنایی با آزمون حساسیت زایی کلیک کنید.

 

آزمون تب‌ زایی درون‌ تنی در مقابل روش‌های جایگزین (BET و MAT)

انتخاب بین روش‌های مختلف تشخیص پیروژن، بر اساس نوع محصول و قابلیت اجرای هر روش تعیین می‌شود:

آزمون اندوتوکسین باکتریایی (BET / LAL Test)

روش BET (Bacterial Endotoxin Test)، مبتنی بر واکنش لیزات آمیبوسیت خرچنگ نعل‌اسبی (Limulus Amoebocyte Lysate) است و تنها اندوتوکسین‌های باکتری‌های گرم‌منفی را شناسایی می‌کند. این روش سریع‌تر، ارزان‌تر و قابل‌کمّی‌سازی‌تر از آزمون خرگوشی است و طبق دستورالعمل‌های نظارتی، در صورت اعتبارسنجی موفق برای یک محصول خاص، جایگزین ترجیحی آزمون تب‌زایی درون‌تنی محسوب می‌شود.

آزمون فعال‌سازی مونوسیت (MAT – Monocyte Activation Test)

روش MAT یک آزمون in vitro مبتنی بر واکنش سلول‌های ایمنی انسانی (مونوسیت‌ها) است و برخلاف BET، قادر به شناسایی هم اندوتوکسین‌ها و هم پیروژن‌های غیراندوتوکسینی (مانند برخی قارچ‌ها، ویروس‌ها و محصولات باکتریایی دیگر) است. این ویژگی، MAT را به نزدیک‌ترین جایگزین علمی برای آزمون تب‌زایی درون‌تنی خرگوشی تبدیل کرده.

چه زمانی از آزمون تب‌ زایی درون‌ تنی (خرگوشی) استفاده می‌شود؟

با توجه به الزامات کاهش استفاده از حیوانات آزمایشگاهی در بسیاری از فارماکوپه‌های به‌روز، آزمون خرگوشی معمولاً در شرایط زیر همچنان کاربرد دارد:

• محصولاتی که ماتریکس آن‌ها با آزمون BET تداخل دارد و اعتبارسنجی BET برایشان ممکن نیست
• زمانی که احتمال وجود پیروژن‌های غیراندوتوکسینی مطرح باشد و امکان انجام MAT فراهم نباشد
• برخی الزامات رگولاتوری خاص کشوری یا محصولاتی با سابقه ثبت قدیمی‌تر

جدول مقایسه روش‌های تشخیص پیروژن

سؤالات متداول

آزمون تب‌ زایی درون‌ تنی چه زمانی الزامی است؟ عمدتاً برای فرآورده‌های تزریقی و استریل که آزمون BET برای آن‌ها قابل اعتبارسنجی نیست یا احتمال وجود پیروژن‌های غیراندوتوکسینی وجود دارد.

تفاوت آزمون تب‌ زایی درون‌ تنی با آزمون اندوتوکسین باکتریایی چیست؟ آزمون تب‌زایی درون‌تنی روی خرگوش زنده انجام می‌شود و هم اندوتوکسین و هم پیروژن‌های غیراندوتوکسینی را شناسایی می‌کند؛ در حالی که BET یک آزمون آزمایشگاهی سریع‌تر است که تنها اندوتوکسین باکتری‌های گرم‌منفی را تشخیص می‌دهد.

چرا حتی پس از استریل کردن، آزمون تب‌ زایی لازم است؟ برخی پیروژن‌ها، به‌ویژه اندوتوکسین‌های باقی‌مانده از باکتری‌های از بین‌رفته، در برابر فرآیندهای استریلیزاسیون حرارتی مقاوم هستند و همچنان می‌توانند در بدن انسان واکنش تب‌زا ایجاد کنند؛ به همین دلیل این آزمون به‌عنوان لایه نهایی کنترل کیفیت ضروری است.

 

آزمایشگاه همکار نیکوفارمد با بهره‌مندی از تجهیزات پیشرفته، حیوانات آزمایشگاهی استاندارد و تیم متخصص در فارماکوپه‌های بین‌المللی، خدمات آزمون تب‌زایی درون‌تنی طبق <USP 151> را با دقت و انطباق کامل با الزامات GMP ارائه می‌دهد. این آزمون که نقش حیاتی در اطمینان از عدم وجود پیروژن در فرآورده‌های تزریقی دارد، در نیکوفارمد تحت شرایط کنترل‌شده و با پایش دقیق دمای بدن خرگوش‌ها انجام می‌شود تا کوچک‌ترین میزان تب‌زا نیز شناسایی شود. همکاری با نیکوفارمد یعنی تضمین ایمنی محصول، جلوگیری از ریسک‌های بالینی و دریافت گزارش‌های علمی معتبر که مورد تأیید مراجع نظارتی است.