مایکوپلاسما یکی از عوامل رایج آلودگی در محیط‌های کشت سلولی است که این میکروارگانیسم‌ها به دلیل نبود دیواره سلولی و ویژگی‌های بیولوژیکی خاص، شناسایی آنها با روش‌های معمول دشوار است.
برای تشخیص مایکوپلاسما، دو روش اصلی به کار گرفته می‌شود: روش کشت و روش PCR.
آزمون تشخیص مایکوپلاسما به روش کشت طبق <USP <63 و آزمون تشخیص مایکوپلاسما به روش PCR طبق USP <63>  USP<1223 انجام می شود.
هر یک از این روش‌ها مزایا و محدودیت‌هایی دارند و بر اساس نیازهای پژوهشی و امکانات آزمایشگاهی انتخاب می‌شوند.مایکوپلاسماها گروهی از باکتری‌های بدون دیواره سلولی هستند که در آزمایشگاه‌های کشت سلولی از جمله آلاینده‌های رایج به‌شمار می‌روند. آلودگی مایکوپلاسما می‌تواند تأثیرات جدی بر نتایج تحقیقاتی و کاربردهای بیولوژیکی داشته باشد. به دلیل ماهیت بدون دیواره سلولی این باکتری‌ها، شناسایی آنها با روش‌های معمولی میکروبیولوژی دشوار است و به روش‌های مولکولی نظیر PCR نیازمندیم.

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) یک روش سریع و دقیق برای تشخیص آلودگی مایکوپلاسما است. این روش بر اساس تکثیر اختصاصی توالی‌های ژنومی مایکوپلاسما عمل می‌کند و حساسیت بالایی دارد. از آنجا که مایکوپلاسماها توالی‌های ژنتیکی منحصربه‌فردی دارند، پرایمرهای خاصی برای تکثیر بخش‌های هدف از DNA این باکتری‌ها طراحی می‌شوند.

جهت دریافت خدمات و مشاوره رایگان با نیکوفامد تماس بگیرید.

مراحل انجام آزمون تشخیص مایکوپلاسما به روش PCR

 استخراج DNA

در اولین مرحله DNA از نمونه مورد نظر (مانند محیط کشت سلولی یا نمونه بالینی) استخراج می‌شود. این کار می‌تواند با استفاده از کیت‌های آماده تجاری یا روش‌های سنتی مانند استفاده از فنل-کلروفرم و الکل انجام شود. هدف این مرحله، جداسازی و خالص‌سازی DNA برای استفاده در واکنش PCR است.

طراحی پرایمرها

پرایمرهایی که برای این روش طراحی می‌شوند، به صورت اختصاصی توالی‌های منحصر به‌فرد مایکوپلاسما را هدف قرار می‌دهند. معمولاً این پرایمرها از نواحی حفاظت‌شده ژن ریبوزومی 16S مایکوپلاسما استخراج می‌شوند تا از تداخل با DNA سلولی انسانی جلوگیری شود.

 آماده‌سازی مخلوط PCR

واکنش PCR شامل موارد زیر است:

پرایمرهای اختصاصی برای تکثیر توالی هدف.

آنزیم Taq پلیمراز جهت تکثیر DNA.

dNTPها به عنوان واحدهای سازنده DNA.

بافر واکنش جهت ایجاد شرایط بهینه برای فعالیت آنزیم.

DNA استخراج‌شده به‌عنوان الگو.

 اجرای واکنش در دستگاه ترموسایکلر

واکنش PCR طی چرخه‌های دمایی زیر انجام می‌شود:

دناتوراسیون اولیه (95 درجه سانتی‌گراد): جداسازی رشته‌های DNA دوگانه.

اتصال پرایمرها (55-60 درجه سانتی‌گراد): اتصال پرایمرها به توالی هدف.

گسترش (72 درجه سانتی‌گراد): تکثیر رشته جدید DNA توسط آنزیم پلیمراز.

این چرخه‌ها معمولاً 30 تا 40 بار تکرار می‌شوند تا مقدار کافی از DNA هدف تکثیر یابد.

آنالیز محصولات PCR

پس از تکمیل واکنش، محصولات تکثیر یافته با روش الکتروفورز روی ژل آگارز بررسی می‌شوند. وجود باند مشخص در محل مورد انتظار (بر اساس اندازه توالی هدف) نشان‌دهنده حضور مایکوپلاسما است.

کنترل‌های لازم

کنترل مثبت: استفاده از DNA مایکوپلاسما به‌عنوان نمونه مثبت برای اطمینان از عملکرد صحیح پرایمرها و واکنش.

کنترل منفی: استفاده از آب مقطر یا DNA سلولی فاقد مایکوپلاسما برای جلوگیری از بروز نتایج کاذب مثبت.

کنترل داخلی: افزودن DNA انسانی به‌عنوان کنترل برای تایید عملکرد صحیح واکنش بدون تداخل با توالی مایکوپلاسما.

مقایسه روش‌های کشت و PCR برای تشخیص مایکوپلاسما

روش کشت روش PCR
تعریف استفاده از محیط‌های اختصاصی برای رشد مایکوپلاسما و بررسی کلونی‌های آن. تشخیص سریع از طریق تکثیر اختصاصی DNA مایکوپلاسما با پرایمرهای خاص.
حساسیت متوسط؛ ممکن است مایکوپلاسما در مقادیر کم شناسایی نشود. بالا؛ حتی مقادیر بسیار کم DNA قابل شناسایی است.
اختصاصیت وابسته به نوع محیط کشت و شرایط انکوباسیون؛ ممکن است نتایج کاذب ایجاد شود. بسیار اختصاصی؛ بر اساس توالی‌های DNA مایکوپلاسما عمل می‌کند.
زمان انجام طولانی؛ بین 4 تا 14 روز برای رشد و شناسایی نیاز دارد. سریع؛ در عرض چند ساعت نتایج ارائه می‌شود.
تجهیزات مورد نیاز تجهیزات پایه‌ای مانند انکوباتور و محیط‌های کشت خاص. تجهیزات پیشرفته مانند دستگاه ترموسایکلر و کیت‌های PCR.
هزینه کم تا متوسط؛ به دلیل هزینه پایین محیط‌های کشت. بالا؛ به دلیل نیاز به مواد و تجهیزات پیشرفته.
نیاز به تخصص نیازمند تخصص در شناسایی کلونی‌ها و تفسیر نتایج کشت. نیازمند تخصص در طراحی و انجام PCR و تفسیر داده‌های مولکولی.
محدودیت‌ها  زمان‌بر و حساسیت کمتر در مقایسه با PCR. – مناسب برای گونه‌هایی که به سرعت رشد می‌کنند.  حساسیت به آلودگی محیطی که می‌تواند نتایج کاذب ایجاد کند. – هزینه بالا در مقایسه با روش کشت.
مزایا  روش استاندارد مرجع (gold standard). – نیازمند تجهیزات ساده‌تر.  سرعت و دقت بالا. – قابلیت شناسایی مقادیر اندک مایکوپلاسما.

تجهیزات، ملزومات پزشکی و داروهایی که به آزمون مایکوپلاسما نیاز دارند

مایکوپلاسما به دلیل توانایی آلوده کردن محیط‌های کشت سلولی، داروهای زیستی و ملزومات پزشکی، یکی از چالش‌های مهم در حوزه تولید دارو، بیوتکنولوژی و پزشکی است. برای تضمین ایمنی و کیفیت محصولات زیستی، بسیاری از تجهیزات، ملزومات و داروها به انجام آزمون‌های مایکوپلاسما نیاز دارند. در ادامه به صورت تخصصی این موارد بررسی می‌شود:

داروهای زیستی (بیوفارماسیوتیکال‌ها)

مایکوپلاسما یکی از آلاینده‌های بالقوه در تولید داروهای زیستی است. این داروها شامل موارد زیر هستند:

واکسن‌ها

واکسن‌های ویروسی تولید شده در سلول‌های کشت

پروتئین‌های نوترکیب

آنتی‌بادی‌های مونوکلونال

هورمون‌های زیستی مانند انسولین، هورمون رشد انسانی (hGH)، و اریتروپویتین

داروهای ژن‌درمانی و سلول‌درمانی

محصولات مبتنی بر سلول‌های بنیادی

سلول‌های مهندسی‌شده مانند CAR-T

وکتورهای ویروسی (مانند لنتی‌ویروس و AAV) برای انتقال ژن

 تجهیزات و ملزومات پزشکی مرتبط با کشت سلولی

مایکوپلاسما به طور خاص در محیط‌های کشت سلولی شایع است و می‌تواند تجهیزات و ملزومات پزشکی زیر را آلوده کند:

بیورآکتورها

دستگاه‌هایی که برای تولید سلول‌ها و مواد زیستی استفاده می‌شوند.

محیط‌های کشت سلولی

محیط‌های کشت مایع و جامد که سلول‌ها در آن رشد می‌کنند.

مواد افزودنی محیط کشت

سرم جنین گاوی (FBS) و سایر مواد مکمل.

لوازم یک‌بارمصرف آزمایشگاهی

پتری‌دیش‌ها، فلاسک‌های کشت و میکروتیوب‌ها.

تجهیزات پایدارسازی محیط کشت

انکوباتورها و هودهای لامینار.

 خطوط سلولی و مواد بیولوژیکی تحقیقاتی

خطوط سلولی که برای تحقیقات یا تولید محصولات زیستی استفاده می‌شوند، بسیار مستعد آلودگی مایکوپلاسما هستند:

خطوط سلولی انسانی و حیوانی

سلول‌های CHO (سلول تخمدان همستر چینی).

سلول‌های HEK293 (سلول‌های کلیه جنین انسانی).

سلول‌های بنیادی مزانشیمی و پرتوان.

ویروس‌ها و پلاسمیدهای تحقیقاتی

مورد استفاده در آزمایش‌های ویروسی یا انتقال ژن.

پروتئین‌ها و آنتی‌بادی‌های تولیدی

تولیدشده از سلول‌های کشت.

4. محصولات دارویی مشتق از مواد خام زیستی

محصولات دارویی تولید شده از مواد اولیه زیستی به دلیل احتمال آلودگی به مایکوپلاسما باید تحت آزمون قرار گیرند:

مواد مشتق از پلاسما

ایمونوگلوبولین‌ها، فاکتورهای انعقادی و آلبومین.

مواد پروتئینی خام

عصاره‌های پروتئینی یا مواد نوترکیب.

5. ملزومات و تجهیزات پزشکی مرتبط با بیماران

برخی تجهیزات و محصولات پزشکی که به طور مستقیم با بدن بیمار یا مواد زیستی در تماس هستند، نیازمند بررسی آلودگی به مایکوپلاسما هستند:

ایمپلنت‌های زیستی

پروتزهای زیستی یا تکه‌های بافت مصنوعی.

کیت‌های تشخیصی پزشکی

ابزارهای تشخیص مولکولی و زیستی که حاوی مواد بیولوژیکی هستند.

محصولات مرتبط با تزریق و کشت سلولی

دستگاه‌های انتقال و تجهیزات پزشکی استفاده‌شده در درمان با محصولات زیستی.

6. محصولات آرایشی و بهداشتی مرتبط با بیوتکنولوژی

محصولات آرایشی و بهداشتی که از مواد زیستی تولید می‌شوند نیز به آزمون مایکوپلاسما نیاز دارند:

محصولات حاوی سلول‌های کشت‌شده

کرم‌ها و سرم‌های پوستی با ترکیبات سلولی یا پروتئینی.

مواد خام زیستی مورد استفاده در محصولات آرایشی

فاکتورهای رشد، کلاژن و الاستین.

آزمایشگاه همکار نیکوفارمد یکی از مراکز تخصصی در حوزه کنترل کیفیت محصولات زیستی، دارویی، و تجهیزات پزشکی است که با بهره‌گیری از فناوری‌های پیشرفته و استانداردهای بین‌المللی، خدمات شناسایی و تشخیص آلودگی‌های بیولوژیکی از جمله مایکوپلاسما را ارائه می‌دهد. این آزمایشگاه آزمون تشخیص مایکوپلاسما را به دو روش استاندارد کشت و PCR انجام می‌دهد که هر یک از این روش‌ها با توجه به هدف و نیاز مشتریان قابل انجام است.