آزمون های مولکولی به مجموعهای از آزمایشها گفته میشود که برای مطالعه ویژگیهای سلولها و مولکولهای زیستی نظیر DNA، RNA، پروتئینها و متابولیتها انجام میشود. این آزمونها معمولاً در حوزههای زیستشناسی، پزشکی، ژنتیک و بیوتکنولوژی استفاده میشوند و نقش مهمی در درک عملکردهای زیستی، تشخیص بیماریها، و توسعه درمانها دارند.
مایکوپلاسما بهعنوان یکی از رایجترین آلودگیهای محیطهای کشت سلولی شناخته میشود که میتواند بر نتایج آزمایشهای زیستی و مولکولی تأثیر منفی بگذارد.
برای شناسایی این آلودگی، دو روش اصلی وجود دارد: روش کشت (Culture) و روش PCR (واکنش زنجیرهای پلیمراز).
مایکوپلاسما و دلایل اهمیت شناسایی آن
مایکوپلاسما گروهی از باکتریهای کوچک، انعطافپذیر و فاقد دیواره سلولی هستند که توانایی رشد در محیطهای مختلف را دارند. این ارگانیسمها به دلیل ویژگیهای خاصشان (مثل کوچک بودن، عبور از فیلترها، و مقاومت به برخی آنتیبیوتیکها) اغلب از طریق سرمهای آلوده، محیط کشت یا کاربر به کشت سلولی منتقل میشوند.
مایکوپلاسما میتواند:
- رشد و تکثیر سلولهای کشتشده را مختل کند.
- بیان ژنها، متابولیسم، و عملکرد سلولی را تغییر دهد.
- نتایج آزمایشها را به شدت دچار خطا کند.
جهت دریافت خدمات و مشاوره رایگان با نیکوفامد تماس بگیرید.
آزمون مایکوپلاسما به روش کشت
روش کشت یکی از تکنیکهای رایج و معتبر برای شناسایی مایکوپلاسما است. در این روش، مایکوپلاسما در محیطهای کشت اختصاصی که ترکیبات لازم برای رشد این باکتری را فراهم میکنند، تکثیر میشود.
مراحل انجام آزمون به روش کشت
جمعآوری نمونه
نمونهها از محیط کشت سلولی، سرم، یا مایعات دیگر مرتبط جمعآوری میشوند.
نمونه باید با دقت گرفته شود تا آلودگی خارجی ایجاد نشود.
انتقال به محیط کشت اختصاصی
محیطهای اختصاصی برای رشد مایکوپلاسما معمولاً حاوی مواد مغذی مورد نیاز برای این باکتریها، نظیر:
کلسترول: بهعنوان بخشی از غشای سلولی مایکوپلاسما.
سرم اسب یا سرم گاوی: بهعنوان منبع مواد مغذی.
محیط PPLO (Pleuropneumonia-Like Organisms): یک محیط پایه مناسب برای کشت مایکوپلاسما.
نمونه به دو نوع محیط منتقل میشود:
محیط کشت مایع (برای رشد پراکنده مایکوپلاسما).
محیط کشت آگار (برای تشکیل کلونیهای قابل مشاهده).
انکوباسیون
نمونهها در دمای 37 درجه سانتیگراد و در شرایط بیهوازی یا نیمههوازی (با استفاده از کیسههای گاز یا جعبههای بیهوازی) انکوبه میشوند.
بررسی رشد مایکوپلاسما
در محیط مایع:
رشد مایکوپلاسما باعث ایجاد کدورت یا تغییرات خاص در محیط مایع میشود.
در محیط جامد (آگار):
کلونیهای مایکوپلاسما زیر میکروسکوپ بررسی میشوند. این کلونیها به دلیل فقدان دیواره سلولی،دارای هسته متراکم در مرکز و لبههای شفافتر هستند.
آزمون مایکوپلاسما به روش PCR
PCR چیست؟
PCR یا واکنش زنجیرهای پلیمراز یک روش مولکولی برای تکثیر اختصاصی قطعاتی از DNA است. این تکنیک، با استفاده از پرایمرهای اختصاصی و آنزیم DNA پلیمراز، توانایی شناسایی حتی مقادیر بسیار اندک DNA مایکوپلاسما را دارد.
در شناسایی مایکوپلاسما، روش PCR با هدف تکثیر توالیهای ژنتیکی خاصی که در ژنوم مایکوپلاسما وجود دارند، طراحی میشود. بهطور معمول، ژنهای کدکننده rRNA 16S، که در گونههای مختلف مایکوپلاسما حفظ شدهاند، هدف اصلی این آزمایش هستند.
مراحل آزمون مایکوپلاسما به روش PCR
جمعآوری نمونه
نمونهها میتوانند شامل محیط کشت سلولی، سرم، سوپرناتانت کشت سلولی، یا مایعات زیستی باشند.
نمونه باید با دقت جمعآوری شود تا از آلودگی خارجی (Contamination) جلوگیری شود.
استخراج DNA
DNA مایکوپلاسما از نمونه استخراج میشود. در این مرحله، از کیتهای اختصاصی استخراج DNA یا روشهای دستی مانند فنل-کلروفرم یا ستونهای سیلیکا استفاده میشود.
استخراج DNA باید با دقت انجام شود تا تضمین شود DNA خالص و بدون مواد بازدارنده (Inhibitor) به PCR منتقل شود.
طراحی پرایمرهای اختصاصی
پرایمرها قطعاتی از DNA هستند که به توالیهای خاص ژنوم مایکوپلاسما متصل میشوند. برای اطمینان از دقت آزمایش، پرایمرهایی طراحی میشوند که تنها با توالیهای مایکوپلاسما (مانند ژن 16S rRNA) جفت شوند.
این طراحی باید طوری باشد که هیچ اتصال غیراختصاصی به سایر DNAهای موجود در نمونه رخ ندهد.
انجام واکنش PCR
مخلوط PCR آماده میشود که شامل مواد زیر است:
DNA الگو (Template DNA): DNA استخراجشده از نمونه.
پرایمرها: پرایمرهای Forward و Reverse برای شناسایی مایکوپلاسما.
dNTPs: نوکلئوتیدهای مورد نیاز برای سنتز DNA.
آنزیم Taq DNA پلیمراز: برای تکثیر DNA در دماهای بالا.
بافر واکنش: برای فراهم کردن شرایط بهینه آنزیم.
آب دیونیزه یا RNase/DNase-free: برای تنظیم حجم نهایی مخلوط.
مخلوط در دستگاه ترموسایکلر (Thermocycler) قرار داده میشود و مراحل زیر تکرار میشود:
Denaturation (دناتوراسیون): حرارت بالا (94-95°C) باعث جدا شدن دو رشته DNA میشود.
Annealing (اتصال پرایمر): در دمای پایینتر (50-60°C)، پرایمرها به توالی مکمل خود در DNA متصل میشوند.
Extension (گسترش): در دمای حدود 72°C، DNA پلیمراز توالی جدید را سنتز میکند.
تحلیل محصول PCR
محصول تکثیرشده (آمپلیکون) توسط الکتروفورز ژل آگارز مورد بررسی قرار میگیرد.
باندهای DNA با اندازه مشخص (معمولاً بین 200 تا 500 جفتباز، بسته به نوع پرایمرها) نشاندهنده وجود مایکوپلاسما در نمونه است.
اگر از PCR واقعی (Real-Time PCR) استفاده شود، نتایج بهصورت کمی و در زمان واقعی (Real-Time) تحلیل میشود.
تفاوت روش مایکوپلاسما به روش کشت و روش PCR
تشخیص مایکوپلاسما بهعنوان یکی از مهمترین آلودگیها در محیطهای کشت سلولی، با روشهای مختلفی انجام میشود. دو روش رایج برای این کار، روش کشت (Culture) و روش PCR (واکنش زنجیرهای پلیمراز) هستند. هر یک از این روشها مزایا و معایب خاص خود را دارند و در شرایط مختلف بهکار گرفته میشوند. در ادامه، بهصورت تخصصی تفاوتهای این دو روش از منظر علمی و عملی بررسی شده است.
سرعت انجام آزمایش
- روش کشت:
یک روش زمانبر است؛ زیرا مایکوپلاسما برای رشد نیاز به انکوباسیون طولانیمدت دارد (حدود 7 تا 28 روز بسته به گونه).
رشد و مشاهده کلونیها به زمان زیادی نیاز دارد.
- روش PCR:
یک روش سریع است که نتایج آن معمولاً در عرض چند ساعت (4-6 ساعت) به دست میآید.
نیازی به انکوباسیون طولانیمدت ندارد.
حساسیت (Sensitivity)
- روش کشت:
حساسیت روش کشت پایینتر است و معمولاً تنها در صورت وجود تعداد کافی مایکوپلاسما در نمونه (حداقل 10310^3 تا 10410^4 CFU/mL) قابل شناسایی است.
مایکوپلاسماهایی که توانایی رشد در محیط کشت ندارند، شناسایی نمیشوند.
- روش PCR:
حساسیت بسیار بالایی دارد و حتی مقادیر بسیار اندک DNA مایکوپلاسما (در حد چند کپی ژنومی) را شناسایی میکند.
توانایی تشخیص حتی آلودگیهای خفیف را دارد.
اختصاصیت (Specificity)
- روش کشت:
اختصاصیت روش کشت بستگی به طراحی محیط کشت دارد. معمولاً مایکوپلاسماها به دلیل نیاز به مواد مغذی خاص، در محیط کشت عمومی رشد نمیکنند، اما در محیطهای اختصاصی شناسایی میشوند.
در برخی موارد، ممکن است گونههای نزدیک به مایکوپلاسما به اشتباه شناسایی شوند.
- روش PCR:
پرایمرهای اختصاصی که برای توالیهای خاص مایکوپلاسما طراحی شدهاند، دقت بالایی در شناسایی این ارگانیسم دارند.
بهویژه اگر از پرایمرهای هدف ژن rRNA 16S استفاده شود، احتمال نتایج مثبت کاذب بسیار پایین است.
شناسایی مایکوپلاسماهای زنده یا مرده
- روش کشت:
تنها مایکوپلاسماهای زنده و قابل تکثیر در محیط کشت شناسایی میشوند.
این ویژگی میتواند برای اطمینان از حضور مایکوپلاسماهای فعال مفید باشد.
- روش PCR:
DNA مایکوپلاسماهای زنده و مرده را شناسایی میکند.
این میتواند در برخی موارد مشکلساز باشد، زیرا نتایج مثبت ممکن است به دلیل وجود بقایای DNA مایکوپلاسماهای غیرزنده باشد.
تجهیزات و فناوری مورد نیاز
- روش کشت:
نیاز به تجهیزات پیچیده ندارد و معمولاً در آزمایشگاههای میکروبیولوژی قابل انجام است.
تنها به محیط کشت اختصاصی، انکوباتور و میکروسکوپ نیاز دارد.
- روش PCR:
نیازمند تجهیزات پیشرفتهای مانند دستگاه ترموسایکلر (Thermocycler)، ژل الکتروفورز یا دستگاه Real-Time PCR است.
مواد و تجهیزات مورد نیاز برای این روش گرانتر از روش کشت است.
هزینه
- روش کشت:
هزینه کمتری دارد؛ زیرا مواد مصرفی آن مانند محیطهای کشت، مقرونبهصرفه هستند.
اما زمان طولانیتر انجام آزمایش میتواند هزینههای جانبی را افزایش دهد.
- روش PCR:
هزینه بیشتری دارد؛ زیرا از کیتهای اختصاصی، مواد شیمیایی با خلوص بالا و دستگاههای پیشرفته استفاده میکند.
اما به دلیل سرعت بالاتر، ممکن است در شرایطی اقتصادیتر باشد.
کاربردها
- روش کشت:
بیشتر در آزمایشگاههای میکروبیولوژی عمومی و برای شناسایی مایکوپلاسماهای زنده استفاده میشود.
برای تأیید آلودگیهای مزمن در محیطهای کشت سلولی مناسب است.
- روش PCR:
در آزمایشگاههای تحقیقاتی و صنعتی برای شناسایی سریع و دقیق مایکوپلاسما استفاده میشود.
برای کنترل کیفیت کشتهای سلولی و مطالعاتی که نیاز به حساسیت و سرعت بالا دارند، مناسب است.
جمعبندی
- روش کشت:
- مناسب برای شناسایی مایکوپلاسماهای زنده و تأیید آلودگیهای مزمن.
- برای آزمایشگاههای ساده و در مواردی که زمان محدودیت ندارد، انتخاب خوبی است.
- روش PCR:
- یک روش سریع، حساس و دقیق برای تشخیص مایکوپلاسما، بهویژه در محیطهای کشت سلولی و تحقیقات زیستی.
- به دلیل حساسیت بالا و سرعت زیاد، بهویژه در کنترل کیفیت محصولات بیولوژیک و تحقیقات مولکولی، استاندارد طلایی محسوب میشود.
انتخاب بین این دو روش بسته به نیاز آزمایشگاه (سرعت، حساسیت و هزینه) و هدف از تشخیص مایکوپلاسما صورت میگیرد. در بسیاری از موارد، ترکیب این دو روش میتواند نتایج دقیقتری ارائه دهد.
آزمایشگاه همکار نیکوفارمد با بهرهگیری از فناوریهای پیشرفته و استانداردهای جهانی، آزمون مایکوپلاسما را با دقت و حساسیت بالا انجام میدهد. این آزمایشگاه با استفاده از روشهای معتبر مانند کشت اختصاصی مایکوپلاسما و تکنیکهای مولکولی مانند PCR، قادر به شناسایی سریع و دقیق آلودگی مایکوپلاسما در محیطهای کشت سلولی و محصولات بیولوژیک است.