تست کامت (Comet Assay) یک روش پیشرفته و حساس در مطالعات ژنوتوکسیکولوژی است که برای ارزیابی میزان آسیب DNA در سلول‌های منفرد به کار می‌رود. این آزمایش بر اساس الکتروفورز ژل آگاروزی در شرایط قلیایی یا خنثی انجام می‌شود، به‌طوری که پس از لیز شدن غشای سلولی و دناتوره شدن DNA، قطعات آسیب‌دیده تحت تأثیر میدان الکتریکی مهاجرت کرده و الگویی شبیه به دُم دنباله‌دار یک ستاره را تشکیل می‌دهند.
شدت و طول این دُم، که با میکروسکوپ فلورسانس قابل مشاهده است، متناسب با میزان شکست DNA بوده و به‌عنوان معیاری برای سنجش اثرات عوامل جهش‌زا، مواد شیمیایی، داروها یا شرایط محیطی بر پایداری ژنومی استفاده می‌شود. این تست در حوزه‌های مختلفی از جمله تحقیقات سرطان، سم‌شناسی ژنتیکی، فارماکولوژی و زیست‌محیطی کاربرد دارد.
جهت دریافت خدمات و مشاوره رایگان با نیکوفامد تماس بگیرید.
روش انجام تست کامت
تست کامت (Comet Assay) یک روش حساس برای ارزیابی آسیب‌های DNA در سلول‌های منفرد است که در مطالعات ژنوتوکسیکولوژی و زیست‌پزشکی کاربرد دارد. این آزمایش شامل مراحل زیر است:
آماده‌سازی نمونه‌های سلولی
ابتدا سلول‌های مورد بررسی (مانند سلول‌های خون محیطی، سلول‌های کشت‌شده یا بافتی) جمع‌آوری شده و شمارش می‌شوند. سلول‌ها باید زنده و دارای غشای سالم باشند تا نتایج دقیق‌تری به دست آید.
ترکیب سلول‌ها با ژل آگاروز
سلول‌های جداشده در سوسپانسیونی از آگاروز با دمای پایین (کمتر از ۴۲ درجه سانتی‌گراد) معلق شده و روی لام‌های میکروسکوپی پوشیده‌شده با لایه نازکی از آگاروز قرار داده می‌شوند. این لام‌ها برای تثبیت ژل، روی یخ نگهداری می‌شوند تا ژل به‌خوبی جامد شود.
لیز سلولی
پس از تثبیت سلول‌ها، لام‌ها در محلول لیزکننده قوی حاوی مواد شوینده (مانند تریتون X-100) و نمک‌های قلیایی (مانند NaCl و EDTA) قرار داده می‌شوند. این مرحله باعث حل شدن غشای سلولی و هسته‌ای شده و پروتئین‌های متصل به DNA را حذف می‌کند، به‌طوری که فقط ساختارهای نوکلئوئیدی باقی می‌مانند.
دناتوراسیون و پیش‌تیمار قلیایی (در صورت استفاده از روش قلیایی)
برای بررسی شکست‌های تک‌رشته‌ای و نقاط قلیایی ناپایدار، لام‌ها به مدت ۲۰ تا ۴۰ دقیقه در محلول قلیایی (pH>13) قرار داده می‌شوند. این مرحله باعث دناتوره شدن DNA و آشکارسازی آسیب‌های تک‌رشته‌ای می‌شود. اگر هدف مطالعه، بررسی شکست‌های دو‌رشته‌ای باشد، تست در شرایط خنثی (pH 7-8) انجام می‌شود.
الکتروفورز
لام‌ها در تانک الکتروفورز قرار گرفته و میدان الکتریکی اعمال می‌شود. در روش قلیایی، DNA دارای شکست‌های تک‌رشته‌ای، بار منفی بیشتری پیدا کرده و قطعات آسیب‌دیده آن به سمت آند حرکت می‌کنند، درحالی‌که DNA سالم عمدتاً در ناحیه مرکزی باقی می‌ماند. این فرآیند باعث ایجاد الگویی شبیه به دُم دنباله‌دار (کامت) می‌شود. شدت و طول دُم با میزان آسیب DNA متناسب است.
رنگ‌آمیزی و مشاهده میکروسکوپی
پس از اتمام الکتروفورز، نمونه‌ها با رنگ‌های فلورسانس مانند اتیدیوم بروماید (EtBr) یا SYBR Green رنگ‌آمیزی شده و با استفاده از میکروسکوپ فلورسانس مورد بررسی قرار می‌گیرند. DNA آسیب‌دیده به‌صورت یک هاله نورانی اطراف هسته اصلی سلول مشاهده می‌شود که طول و شدت آن نشان‌دهنده میزان شکست DNA است.
تحلیل داده‌ها
نتایج تست کامت با استفاده از نرم‌افزارهای تحلیل تصویر مانند “CometScore” یا “OpenComet” ارزیابی می‌شوند. پارامترهای مهم شامل طول دُم کامت، نسبت شدت فلورسانس دُم به سر (Tail Moment) و درصد DNA موجود در دُم است که هرکدام معیارهای مستقیمی برای سنجش میزان آسیب DNA به شمار می‌روند.
برای آشنایی بیشتر با آزمون سمیت ژنی کلیک کنید.
عوامل تأثیرگذار بر نتایج تست کامت
این عوامل می‌توانند شامل شرایط نمونه‌گیری، روش انجام آزمایش، عوامل فیزیولوژیکی و متغیرهای محیطی باشند. درک این عوامل برای افزایش دقت و قابلیت تکرارپذیری نتایج این تست ضروری است. در ادامه، مهم‌ترین عوامل تأثیرگذار بر نتایج تست کامت بررسی می‌شوند:
عوامل بیولوژیکی و فیزیولوژیکی
نوع سلول‌های مورد آزمایش
میزان آسیب DNA در سلول‌های مختلف می‌تواند متفاوت باشد. به‌عنوان‌مثال، لنفوسیت‌های خون محیطی نسبت به سلول‌های اپیتلیالی یا بافتی واکنش‌های متفاوتی به عوامل آسیب‌زا نشان می‌دهند.
برخی از سلول‌ها دارای مکانیسم‌های ترمیم DNA قوی‌تری هستند که بر نتایج تأثیر می‌گذارد.
وضعیت متابولیکی سلول‌ها
سلول‌هایی که در فاز فعال چرخه سلولی قرار دارند (مانند فاز S) نسبت به سلول‌های در حال استراحت (G0) حساس‌تر به آسیب‌های DNA هستند.
استرس اکسیداتیو ناشی از افزایش متابولیسم می‌تواند باعث افزایش شکست‌های DNA شود.
تفاوت‌های فردی و ژنتیکی
ژنتیک افراد بر حساسیت سلول‌هایشان نسبت به آسیب DNA تأثیر می‌گذارد.
وجود اختلالات ژنتیکی مرتبط با ترمیم DNA (مانند بیماری‌های مرتبط با نقص در سیستم ترمیم DNA) می‌تواند بر نتایج تست تأثیر بگذارد.
عوامل مرتبط با نمونه‌گیری و آماده‌سازی سلول‌ها
نحوه جمع‌آوری و ذخیره‌سازی نمونه
تأخیر در فرآیند آزمایش پس از جمع‌آوری نمونه می‌تواند باعث تخریب خودبه‌خودی DNA شود.
نگهداری نامناسب نمونه (مانند دمای نامناسب یا قرار گرفتن در معرض اکسیژن) می‌تواند باعث تغییر در میزان آسیب DNA شود.
روش جداسازی سلول‌ها
استفاده از آنزیم‌های هضم‌کننده یا روش‌های مکانیکی برای جداسازی سلول‌ها از بافت ممکن است خود باعث آسیب به DNA شود.
برخی روش‌های جداسازی می‌توانند استرس مکانیکی به سلول‌ها وارد کنند که باعث افزایش شکست‌های DNA می‌شود.
شرایط کشت سلولی (در صورت استفاده از سلول‌های کشت‌شده)
مدت‌زمان کشت و نوع محیط کشت می‌تواند میزان استرس سلولی و آسیب DNA را تحت تأثیر قرار دهد.
وجود فاکتورهای رشد یا آنتی‌بیوتیک‌ها در محیط کشت ممکن است به‌صورت غیرمستقیم بر نتایج تست کامت تأثیر بگذارد.
عوامل فنی و روش‌شناسی در اجرای تست کامت
غلظت و دمای آگارز
غلظت نامناسب آگارز ممکن است بر میزان مهاجرت DNA در ژل تأثیر بگذارد.
دمای نامناسب در هنگام ریختن آگارز می‌تواند باعث استرس حرارتی در سلول‌ها شده و نتایج را تحت تأثیر قرار دهد.
میزان و مدت‌زمان الکتروفورز
تنظیمات ولتاژ و مدت‌زمان الکتروفورز نقش مهمی در نحوه مهاجرت DNA دارند.
افزایش بیش‌ازحد ولتاژ ممکن است منجر به تخریب DNA و ارائه نتایج نادرست شود.
شرایط لیز سلولی
استفاده از محلول‌های نامناسب برای لیز کردن سلول‌ها می‌تواند به حذف ناقص پروتئین‌های سلولی منجر شود و بر تفسیر نتایج اثر بگذارد.
دمای لیزینگ باید ثابت باشد، زیرا نوسانات دمایی ممکن است بر میزان آسیب DNA تأثیر بگذارد.
مدت و شرایط قلیایی یا خنثی‌سازی
در روش قلیایی تست کامت، مدت‌زمانی که سلول‌ها در محلول قلیایی قرار می‌گیرند بر میزان آشکار شدن شکست‌های DNA اثر دارد.
تنظیم دقیق pH و مدت‌زمان قرار گرفتن در معرض محیط قلیایی ضروری است تا از تخریب بیش‌ازحد DNA جلوگیری شود.
عوامل محیطی و تأثیرات خارجی
استرس اکسیداتیو و رادیکال‌های آزاد
وجود رادیکال‌های آزاد در محیط می‌تواند باعث آسیب DNA و افزایش میزان شکست‌های DNA در تست کامت شود.
کیفیت هوای آزمایشگاه و وجود آلودگی‌های زیست‌محیطی نیز بر نتایج تست تأثیرگذار است.
دما و شرایط نگهداری در حین انجام تست
تغییرات دمایی در مراحل مختلف تست می‌تواند منجر به تغییر در الگوی شکست‌های DNA شود.
برخی مطالعات نشان داده‌اند که نگهداری طولانی‌مدت نمونه‌ها در دمای نامناسب ممکن است باعث تغییر در میزان آسیب DNA شود.
نوع بافرهای مورد استفاده
استفاده از بافرهای نامناسب ممکن است بر پایداری DNA تأثیر گذاشته و منجر به نتایج غیرقابل‌اعتماد شود.
انتخاب مناسب بافر برای مراحل لیز، الکتروفورز و خنثی‌سازی اهمیت زیادی دارد.
عوامل مرتبط با تحلیل داده‌ها
انتخاب نرم‌افزار تحلیل داده
نرم‌افزارهای مختلف تحلیل داده‌های تست کامت ممکن است نتایج متفاوتی ارائه دهند.
الگوریتم‌های پردازش تصویر و پارامترهای مورد استفاده در نرم‌افزارها بر میزان ثبت آسیب‌های DNA تأثیر دارند.
انتخاب شاخص‌های مناسب برای تفسیر نتایج
معمولاً در تحلیل تست کامت از پارامترهایی مانند طول دم، شدت فلورسانس دم و نسبت دم به سر استفاده می‌شود.
انتخاب پارامتر نامناسب ممکن است منجر به تحلیل نادرست نتایج شود.
نتایج تست کامت می‌توانند تحت تأثیر طیف گسترده‌ای از عوامل بیولوژیکی، فنی و محیطی قرار بگیرند. از انتخاب نوع سلول گرفته تا شرایط اجرای تست و نحوه تحلیل داده‌ها، هر مرحله می‌تواند بر دقت و صحت نتایج تأثیر بگذارد. به‌منظور دستیابی به داده‌های قابل اعتماد، کنترل دقیق تمامی این عوامل و استانداردسازی پروتکل‌های آزمایشگاهی ضروری است.
آزمایشگاه همکار نیکوفارمد با بهره‌گیری از تجهیزات پیشرفته و متخصصان مجرب، تست کامت (Comet Assay) را به‌عنوان یک روش دقیق برای ارزیابی آسیب‌های DNA ناشی از عوامل شیمیایی، دارویی و زیست‌محیطی ارائه می‌دهد. این آزمایشگاه با رعایت استانداردهای بین‌المللی، خدمات خود را به مراکز تحقیقاتی، صنایع داروسازی، بیوتکنولوژی و سم‌شناسی عرضه کرده و نتایج معتبر و قابل استنادی را برای بررسی‌های ژنوتوکسیک و ایمنی زیستی فراهم می‌کند.