شمارش ارگانیسمها به روش کشت در ظرف محیط کشت (Plate Count Method) روشی کمی است که تعداد میکروارگانیسمهای زنده در نمونه را ارزیابی میکند. روش شمارش صفحه ای استاندارد معمولاً برای شمارش باکتریها، مخمرها و کپکها به کار میرود.
چرا شمارش میکروارگانیسمها مهم است؟
آگاهی از تعداد میکروارگانیسمها برای تصمیمگیری در مورد ایمنی و کیفیت تجهیزات پزشکی امری حیاتی است. شمارش دقیق این موجودات امکان ارزیابی میزان آلودگی و انطباق با استانداردهای بهداشتی را فراهم میکند. علاوه بر این، تعیین تعداد میکروارگانیسمها به پژوهشگران اجازه میدهد رشد و تکثیر آنها را تحت شرایط مختلف محیطی، مانند تغییرات دما یا pH، مطالعه کنند.
با توجه به اندازه کوچک میکروارگانیسمها، شمارش آنها به روشهای خاصی نیاز دارد، زیرا نمیتوان با چشم غیرمسلح این موجودات را مشاهده کرد. هرچند استفاده از میکروسکوپ به بررسی آنها کمک میکند، اما برای شمارش دقیق و عملی، دانشمندان روشهای پیشرفتهتری نظیر شمارش کلنیها را ابداع کردهاند که امکان ارزیابی آسانتر و کارآمدتر تعداد سلولهای زنده را فراهم میکند.
جهت دریافت خدمات و مشاوره رایگان با نیکوفامد تماس بگیرید.
استاندارد روش شمارش صفحه ای استاندارد
استاندارد ISO 11373 به روشهای استاندارد شمارش کلی میکروارگانیسمها در نمونههای تجهیز پزشکی میپردازد و تعداد کل میکروارگانیسمهای زنده و فعال (CFU) را که قادر به رشد در شرایط تعریفشده هستند، ارزیابی میکند. این استاندارد شامل جزئیاتی درباره مراحل رقیقسازی، انتخاب محیط کشت مناسب، روشهای کشت (مانند روش ریختن در ظرف و روش کشت سطحی)، انکوباسیون تحت شرایط خاص دما و زمان، و شمارش کلونیها است. هدف آن تضمین دقت و تکرارپذیری نتایج در آزمایشگاههای میکروبیولوژی است و بهعنوان یک روش معتبر برای کنترل کیفی محصولات و پایش آلودگیهای میکروبی استفاده میشود.
روش استاندارد شمارش میکروبی در ظرف محیط کشت (SPC) برای تجهیزات پزشکی
روش شمارش صفحه ای استاندارد در ظرف محیط کشت برای تجهیزات پزشکی برای بررسی بار میکروبی و تعیین تعداد میکروارگانیسمهای زنده بر روی تجهیزات پزشکی استفاده میشود. این روش برای ارزیابی سطح استریلیزاسیون و کنترل کیفیت تجهیزات پزشکی، بهویژه مواردی که در تماس با بافتها، خون یا مایعات بدن هستند، به کار میرود.
اهدف روش SPC در تجهیزات پزشکی تعیین تعداد میکروارگانیسمهای زنده باقیمانده روی تجهیزات پزشکی قبل و بعد از فرایند استریلیزاسیون، کنترل کیفیت و اطمینان از این که تجهیزات پزشکی با استانداردهای بهداشتی و میکروبیولوژیکی سازگار هستند و ارزیابی فرایند استریلیزاسیون جهت بررسی کارایی روشهای استریلیزاسیون مانند روشهای اتوکلاو، اتیلن اکساید یا پرتودهی است.
لوازم و مواد مورد نیاز شامل ابزارها یا سطوحی که مورد آزمایش قرار میگیرند (مانند کاتترها، پروتزها و … )، محلول شستشو و رقیقکننده استریل (شامل آب استریل، محلول نمکی 0.85% یا پپتون 0.1% برای شستشو و تهیه رقتها)، ظروف و محیطهای کشت، (محیط کشت عمومی مانند پلیت کانت آگار یا محیط کشت انتخابی برای مانند تیوگلیکولات برای بیهوازیها)، ابزار استریل برای انتقال نمونه (مانند پیپت)، گرمخانه برای نگهداری محیط کشت در دمای مناسب (مثلا دمای 38-36 درجه سلسیوس برای رشد میکروارگانیسمهای مزوفیل و هوازی) و دستگاه کلنی کانتر برای شمارش دقیق تعداد کلنیها است.
برای آشنایی با آزمون بایوبردن کلیک کنید.
روش انجام روش شمارش صفحه ای استاندارد در ظرف محیط کشت
استاندارد ISO 11373 به عنوان مرجع جهانی برای روشهای شمارش میکروبی در ظرف محیط کشت (plate count method) در میکروبیولوژی ابزار پزشکی استفاده میشود. این روش یکی از مهمترین و متداولترین روشها برای شمارش کلونیهای میکروبی است که امکان بررسی تعداد زنده میکروارگانیسمها در نمونهها را فراهم میکند.
آمادهسازی نمونه و رقتسازی
نمونه اولیه ابتدا با استفاده از یک مایع رقیقکننده ایزوتونیک (مانند محلول نمکی بافر یا آب پپتون) بهصورت همگن درآورده میشود.
سپس، رقتهای متوالی (معمولاً 1:10) از نمونه تهیه میشود. هدف این است که تراکم میکروارگانیسمها به حدی برسد که تعداد کلونیها در محدوده قابل شمارش (بین 30 تا 300 کلونی در هر ظرف محیط کشت) باشد.
انتخاب محیط کشت مناسب
بسته به نوع میکروارگانیسم هدف، محیط کشت مناسب انتخاب میشود.
برای شمارش کلی باکتریها، از محیط کشت پلیت کانت آگار (PCA) یا تریپتیک سوی آگار (TSA) استفاده میشود.
برای مخمرها و کپکها از محیطهایی مانند سابوراد دکستروز آگار (SDA) یا پوتیتو دکستروز آگار (PDA) بهره گرفته میشود.
کشت نمونه
برای کشت نمونه از روش ریختن در ظرف محیط کشت (Pour Plate) یا کشت سطحی (Spread Plate) استفاده میشود:
در روش ریختن در ظرف محیط کشت نمونه رقیقشده مستقیماً در ظرف استریل ریخته شده و سپس محیط کشت ذوبشده و خنک شده (تا دمای 45-50 درجه سانتیگراد) اضافه میشود.
در روش کشت سطحی مقدار مشخصی از نمونه رقیقشده روی سطح محیط کشت جامد ریخته میشود و ابزار استریل بهطور یکنواخت پخش میشود.
انکوباسیون
ظروف محیط کشت در دمای مناسب (معمولاً 30 تا 35 درجه سانتیگراد برای باکتریها یا 20 الی 25 درجه سانتیگراد برای قارچها) و مدت زمان معین (اغلب حدود 24 الی 72 ساعت) در انکوباتور قرار میگیرند. شرایط هوازی یا بیهوازی با توجه به نیاز میکروارگانیسم هدف کنترل میشود.
شمارش کلونیها
بعد از انکوباسیون، کلونیهای تشکیلشده با چشم غیرمسلح یا با کمک دستگاههای شمارنده (Colony Counter) شمارش میشوند.
زمانی که رقتهای مختلف از نمونه کشت داده شده باشد، تنها ظروف محیط کشت با تعداد کلونی در محدوده 30 تا 300 بررسی میشوند. در صورتی که تعداد کلونیها خارج از این محدوده باشد، رقت مناسبتر انتخاب میشود.
محاسبات
تعداد میکروارگانیسم در نمونه بر حسب (CFU/mL یا g) = تعداد کل کلونیها × فاکتور رقت/ حجم نمونهی رقیقشده
نتیجهگیری
روش شمارش میکروبی در ظرف محیط کشت برای تجهیزات پزشکی، یک روش کارآمد و دقیق برای ارزیابی کیفیت میکروبی آن است. این روش نقش کلیدی در تضمین ایمنی و بهداشت در تجهیزات پزشکی دارد و رعایت دقیق پروتکلها و استانداردهای بهداشتی در انجام این آزمایش ضروری است.