تست MTT یکی از آزمونهای زیستسازگاری است که طبق استاندارد ISO 10993-5 برای ارزیابی سمیت سلولی مواد مورد استفاده قرار میگیرد. هدف از این تست، بررسی تأثیر یک ماده (مثل دارو، مواد زیستی، یا مواد تولیدی) بر زندهماندن و تکثیر سلولها است.
در تست MTT، سلولها در مجاورت ماده مورد آزمایش قرار میگیرند و میزان فعالیت متابولیکی سلولها بررسی میشود. ماده MTT به وسیله سلولهای زنده به فرمازان (یک ترکیب آبی نامحلول) کاهش مییابد که میزان آن نشاندهنده تعداد سلولهای زنده است. در نهایت، جذب نوری محلول حاصل با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر اندازهگیری میشود که از این دادهها میتوان به میزان زندهمانی یا مرگ سلولی پی برد.
جهت دریافت خدمات و مشاوره رایگان با نیکوفامد تماس بگیرید.
تست رنگ سنجی MTT چگونه انجام می شود؟
تست رنگسنجی MTT یک روش کلورومتریک است که برای ارزیابی تکثیر سلولی و سمیت عوامل مختلف استفاده میشود. این تست برای اندازهگیری زندهمانی سلولها تحت تأثیر داروها یا سایر عوامل شیمیایی و محیطی به کار میرود. هدف اصلی از این تکنیک، تعیین میزان زندهماندن و رشد سلولها در برابر اثرات یک ماده خاص است.
در این آزمون، از مادهای به نام MTT با فرمول مولکولی C18 H16 BrN5 S استفاده میشود. این ماده که به شکل پودر است، به نور حساس بوده و باید در محلولی مانند PBS حل شود. پس از ورود این محلول زرد رنگ به سلول، از طریق اندوسیتوز به میتوکندری سلول منتقل میشود. در میتوکندری، “آنزیم سوکسینات دهیدروژناز”، که تنها در سلولهای زنده فعال است، MTT را به رسوب فرمازان بنفش رنگ تبدیل میکند.
جذابیت اصلی این فرآیند در اینجاست که فقط سلولهای زنده قادرند MTT را به فرمازان تبدیل کنند، در حالی که سلولهای مرده یا غیر فعال این توانایی را ندارند. رسوبات بنفش فرمازان نامحلول بوده و نمیتوانند از غشای سلول خارج شوند. برای حل کردن این رسوبات و اندازهگیری آنها، از حلالهای آلی مانند DMSO یا SDS در اسید هیدروکلریک رقیق استفاده میشود.
مقدار تولید فرمازان، که با شدت رنگ بنفش مشخص میشود، نشاندهنده تعداد سلولهای زنده است. برای اندازهگیری دقیق، تراکم نوری این محلول در دستگاه اسپکتروفتومتر و در طول موج 579 نانومتر، با طول موج مبنای 630 نانومتر، ثبت میشود. هرچه جذب نوری کمتر باشد، نشاندهنده کاهش تعداد سلولهای زنده و افزایش مرگ سلولی است.
در مقایسه بین سلولهای تیمار شده با داروی خاص و سلولهای شاهد (بدون دارو)، میزان تأثیر ماده مورد نظر بر “مرگ و مهار رشد سلولها” بررسی میشود. یکی از مفاهیم مهم در این تست، “IC50” است، که به غلظتی از دارو اطلاق میشود که در آن نیمی از سلولها زنده و نیم دیگر مردهاند. این شاخص برای تعیین “قدرت سمیت” یا “اثر دارویی” استفاده میشود.
بسته به هدف آزمایش، غلظتهای مختلف دارو بررسی میشود، و در پژوهشها معمولاً از دوزهای بالاتر از IC50 استفاده میشود تا تعداد بیشتری از سلولهای زنده باقی بمانند.
سپس توان حیاتی سلول ها با فرمول ( جذب نمونه ی تیمار شده)/(جذب نمونه ی کنترل) ×۱۰۰= درصد توان حیاتی محاسبه می شود.
جهت کسب اطلاعات بیشتر در رابطه با آزمون سمیت سلولی کلیک کنید.
مراحل تست MTT
مراحل انجام تست MTT به دقت و توجه به جزئیات نیاز دارد تا نتایج دقیق و قابل اعتمادی به دست آید. در ادامه به توضیح مراحل این آزمون میپردازیم:
کاشت سلولها در پلیت 96 خانه
اولین و مهمترین مرحله، کاشت صحیح و یکنواخت سلولها در چاهکهای پلیت 96 خانه است. تعداد سلولهایی که در هر چاهک کاشته میشوند باید با دقت محاسبه شود، چرا که تراکم سلولی تأثیر مستقیمی بر نتایج تست دارد. تعداد مناسب سلولها بسته به نوع سلول و سرعت رشد آنها متغیر است و باید با بررسی مقالات علمی یا آزمون و خطا مشخص شود. شمارش صحیح و همگنسازی سلولها در محلول، از عوامل مهمی هستند که باید به دقت انجام شوند.
انتخاب دوز مناسب دارو
انتخاب دامنه دوز مناسب از دارو مرحله بعدی است که تأثیر زیادی بر دقت نتایج دارد. دوزهای دارو باید به گونهای انتخاب شوند که بتوان اثرات آنها را بهخوبی روی سلولها مشاهده کرد. برای یافتن دوز مناسب میتوانید به مقالات علمی مرتبط رجوع کنید یا از طریق آزمایشهای مقدماتی دامنه مناسب دوزها را تعیین کنید. باید به این نکته توجه داشت که برخی داروها نیاز به غلظتهای پایین و برخی دیگر به غلظتهای بالاتر دارند.
تکرار تستها برای دقت بیشتر
برای افزایش دقت نتایج، هر دوز انتخابی باید در چندین چاهک (حداقل سه چاهک) تکرار شود تا بتوان میانگین دادهها را محاسبه کرد و خطاهای احتمالی کاهش یابد. همچنین، برای هر رده سلولی، تست باید حداقل سه بار تکرار شود تا نتایج نهایی قابل اعتماد باشند.
همگنسازی سلولها
قبل از کاشت سلولها، باید اطمینان حاصل شود که محلول سلولی بهخوبی همگن شده است. این کار تضمین میکند که تراکم سلولها در هر چاهک یکسان بوده و اثرات دارو روی جمعیت سلولی دقیقتر بررسی شود.
مدت زمان اثر دارو
هر دارو زمان متفاوتی برای اعمال اثر خود دارد. برخی داروها طی چند ساعت و برخی دیگر طی چند روز اثر خود را بر سلولها نشان میدهند. این مدت زمان باید با دقت انتخاب شود و معمولاً میتوان از مقالات مرتبط برای تعیین آن استفاده کرد. در غیر این صورت، باید زمانهای مختلفی را امتحان کنید تا مدت زمان مناسب برای داروی مورد آزمایش را بیابید.
افزودن محلول MTT و اندازهگیری جذب نوری
پس از دوره انکوباسیون سلولها با دارو، محلول MTT به چاهکها اضافه میشود و به سلولها اجازه داده میشود که MTT را به رسوب فرمازان بنفش رنگ تبدیل کنند. پس از انحلال رسوبات در حلالهای آلی، مانند DMSO، میزان جذب نوری محلول در طول موج 579 نانومتر (با طول موج مبنای 630 نانومتر) توسط اسپکتروفتومتر اندازهگیری میشود. این مقدار مستقیماً با تعداد سلولهای زنده مرتبط است.
در نهایت، مقایسه میزان فرمازان تولید شده توسط سلولهای تیمار شده با دارو و سلولهای شاهد (بدون دارو) انجام میشود. این مقایسه به شما کمک میکند تا میزان سمیت دارو و اثر آن بر مرگ یا مهار رشد سلولها را بهطور دقیق ارزیابی کنید.
با رعایت این مراحل و توجه به نکات کلیدی، میتوان به نتایج قابل اعتماد و دقیق در تست MTT دست یافت.
برای آشنایی با انواع آزمون زیست سازگاری کلیک کنید.
آزمایشگاه همکار نیکوفارمد با استفاده از تجهیزات پیشرفته و تیم متخصص، خدمات تست MTTرا برای ارزیابی سمیت سلولی مواد دارویی، شیمیایی و بیومواد طبق استاندارد ISO 10993-5 ارائه میدهد.
نیکوفارمد با بهرهگیری از تکنیکهای کلورومتریک و دستگاههای اسپکتروفتومتری، اثرات سمی مواد را با دقت و تکرارپذیری بالا بررسی میکند و با ارائه نتایج دقیق، به شرکتها و مراکز تحقیقاتی در توسعه داروها و ارزیابی زیستسازگاری مواد جدید کمک میکند.